蒽醌類BH3模擬物Compound6誘導黑色素瘤細胞凋亡的分子藥理學機制研究.pdf

1、Bcl-2家族蛋白對于細胞凋亡的調(diào)控起著關(guān)鍵性作用。小分子Bcl-2類蛋白抑制劑是通過模擬促凋亡蛋白BH3-only蛋白，從而抑制抗凋亡蛋白的功能，為新的抗腫瘤治療策略提供了一個非常有前景的方向。
　　黑色素瘤中的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是高度激活的，直接或間接導致了黑色素瘤對目前幾乎所有的治療手段的抗性和不良預后。Bcl-2類蛋白抑制劑在黑色素瘤的分子藥理研究中同樣發(fā)現(xiàn)了抗性問題，可能也和MAPK信號通路的激活有關(guān)

2、。因此，研究Bcl-2類蛋白抑制劑誘導黑色素瘤細胞凋亡的分子機制不僅有助于更深入的了解黑色素瘤的藥物抗性的分子機制，同時也為未來發(fā)展黑色素瘤的治療策略和臨床研究提供了理論依據(jù)。
　　本文對比研究BH3模擬物S1、gossypol和ABT-737在黑色素瘤細胞中的細胞毒性，及這些BH3模擬物對Bcl-2家族蛋白之間相互作用的影響，揭示了高水平磷酸化的抗凋亡蛋白Mcl-1(pMcl-1)是黑色素瘤對目前已知BH3模擬物抗性的關(guān)鍵原因。

3、本課題組設(shè)計合成了一系列蒽醌類BH3模擬物小分子Bcl-2類蛋白抑制劑。與目前其他的BH3模擬物不同的是，它們實現(xiàn)了對重要BH3-only蛋白Bim螺旋的雙面模擬，達到從結(jié)構(gòu)和功能兩個方面模擬Bim蛋白α-螺旋，以高親和力結(jié)合Bcl-2家族中抗凋亡蛋白，并誘導Bax/Bak依賴的內(nèi)源細胞凋亡。本文篩選得到蒽醌類BH3模擬物Compound6。與上述其他BH3模擬物不同的是，Compound6能夠克服黑色素瘤抗性，顯著地誘導黑色素瘤細胞凋

4、亡。
　　通過免疫共沉淀實驗檢測了Compound6對黑色素瘤細胞內(nèi)Bcl-2家族蛋白之間相互作用的影響，并用免疫印跡法檢測了后續(xù)Bax/Bak的激活、細胞色素C釋放、PARP的剪切和caspase-3/9的激活。這些結(jié)果表明Compound6是通過解離細胞中pMcl-1/Bim和pMcl-1/Bak異源二聚體，誘導Bax/Bak依賴的內(nèi)源性細胞凋亡來殺傷黑色素瘤細胞的。
　　本文還利用免疫印跡法分析了ERK抑制劑PD980

5、59和JNK抑制劑SP610025對黑色素瘤中Mcl-1磷酸化水平的影響，結(jié)果表明ERK與JNK都參與了黑色素瘤中Mcl-1蛋白的磷酸化。接下來，通過MTT法檢測了PD98059和SP610025聯(lián)合S1作用在黑色素瘤中的細胞毒性，結(jié)果表明PD98059和SP610025都能顯著地增強黑色素瘤對S1的敏感性，這進一步的證實了是ERK與JNK誘導的Mcl-1磷酸化導致了黑色素瘤對BH3模擬物的抗性。
　　免疫印跡實驗結(jié)果顯示在Com

6、pound6的作用下黑色素瘤中的pMcl-1會發(fā)生降解。接下來，本文利用蛋白酶體抑制劑MG-132和廣譜caspase抑制劑zVADfmk分別與Compound6聯(lián)合作用黑色素瘤細胞，結(jié)果表明Compound6能夠引起的pMcl-1降解是capase依賴的。
　　在本文的研究中還發(fā)現(xiàn)A375細胞在Compound6的作用下會發(fā)生Noxa表達水平的上調(diào)，經(jīng)過進一步使用定量PCR的方法發(fā)現(xiàn)Noxa的上調(diào)是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。最后，利用No

7、xa的shNoxa下調(diào)黑色素瘤中的Noxa蛋白水平，并通過MTT法、免疫印跡法和免疫共沉淀實驗檢測了Compound6在其中的毒性，以及對pMcl-/Bim，pMcl-1/Bak復合物的影響，結(jié)果表明Compound6誘導黑色素瘤細胞凋亡并不依賴于Noxa水平的上調(diào)。
　　本研究首次證實了pMcl-1能夠拮抗的BH3模擬物小分子Bcl-2抑制劑，確定了ERK與JNK都參與了Mcl-1磷酸化并增強其抗凋亡功能，并確定pMcl-1是黑