Survivin的下調(diào)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞凋亡抗性的影響機(jī)制研究.pdf

1、黑色素瘤是發(fā)生在皮膚組織的一種惡性腫瘤,黑色素瘤對人類健康的危害性不斷增長,在已發(fā)現(xiàn)發(fā)生轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者中,平均存活時(shí)間只有6到10個(gè)月。發(fā)生轉(zhuǎn)移的黑色素瘤細(xì)胞具有非常強(qiáng)大的增殖能力,并且對大多數(shù)的腫瘤治療藥物均具有明顯的抗性作用,因此導(dǎo)致對其的治療效果非常不理想。這些治療方案包括多種已用于三期臨床試驗(yàn)的方法,例如免疫治療,細(xì)胞因子治療,放射治療以及化學(xué)治療等。甚至是化學(xué)治療試劑的聯(lián)合使用療法在過去的20年中也沒有改變臨床試驗(yàn)的生存率

2、問題。
　　黑色素瘤對治療藥物的超強(qiáng)抵抗作用主要是與其自身多種細(xì)胞凋亡通路發(fā)生失活有關(guān)。研究表明黑色素瘤細(xì)胞對于藥物治療的高度耐受,因?yàn)楹谏亓黾?xì)胞能夠很好地適應(yīng)治療藥物形成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并逃脫由其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡,從而表現(xiàn)為高度耐受藥物治療。傳統(tǒng)的治療方法不能改善黑色素瘤的生存率問題,究其根本原因是人們對黑色素瘤中細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制缺乏了解,同時(shí),近年來的報(bào)道也證明黑色素瘤具有很強(qiáng)的生存機(jī)制并參與了黑色素瘤對化療藥物的抵抗作

3、用。因此,研究黑色素瘤對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的適應(yīng)機(jī)制顯得尤為重要。
　　目的：研究黑色素瘤細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下的存活機(jī)制及其具體的信號(hào)通路,期望找到能夠成為黑色素瘤治療過程中有效的生物標(biāo)志物的蛋白,以期為黑色素瘤的臨床治療提供新的思路和藥物作用靶點(diǎn)。
　　方法：(1)以黑色素瘤細(xì)胞Mel-RM為研究對象,用衣霉素(TM)處理構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的模型,通過mRNA芯片分析,尋找對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具有抗性的黑色素瘤細(xì)胞差異基因的表達(dá)surv

4、ivin;并采用QRT-PCR、Western Bloting驗(yàn)證芯片結(jié)果,(2)根據(jù)芯片分析結(jié)果,檢測比較內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況下不同黑色素瘤細(xì)胞株中survivin的表達(dá)情況;并利用慢病毒系統(tǒng)篩選survivin穩(wěn)定過表達(dá)的Mel-RM細(xì)胞株,采用衣霉素處理后,利用Hoechst33342染核、MTT法分析細(xì)胞活力、Western Bloting檢測細(xì)胞凋亡的分子標(biāo)志物等方法,檢測survivin過表達(dá)的情況下黑色素瘤細(xì)胞對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)

5、凋亡的變化情況;(3)通過流式細(xì)胞術(shù)及Western Bloting分別檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,觀察在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí),過表達(dá)survivin的黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期變化情況;(4)采用生物信息學(xué)方法分析survivin的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)構(gòu)及潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)survivin的啟動(dòng)子活性在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)被抑制,但外源實(shí)驗(yàn)證實(shí)能夠被E2F1激活,采用RNA干擾方法降低E2F1的蛋白水平后survivin的變化消失。

6、
　　結(jié)果：(1)對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具有抗性的黑色素瘤細(xì)胞在衣霉素處理時(shí)survivin的mRNA和蛋白水平下調(diào),而且這種改變是黑色素瘤細(xì)胞所特有;(2)survivin的下調(diào)與黑色素瘤對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抗性相關(guān),而且外源過表達(dá)survivin后降低了黑色素瘤細(xì)胞對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抗性;(3)survivin的下調(diào)是通過形成細(xì)胞周期阻滯來保護(hù)黑色素瘤細(xì)胞,從而表現(xiàn)為適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;外源過表達(dá)survivin后,促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞通過G1期阻

7、滯,從而減弱黑色素瘤細(xì)胞對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抗性;(4)survivin在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況下受E2F1轉(zhuǎn)錄調(diào)控。E2F1蛋白水平在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)降低,從而減弱對于survivin的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。外源過表達(dá)E2F1同樣降低黑色素瘤細(xì)胞對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抗性。
　　結(jié)論：研究發(fā)現(xiàn)survivin的下調(diào)對于黑色素瘤細(xì)胞逃脫內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡至關(guān)重要,穩(wěn)定過表達(dá)survivin的黑色素瘤細(xì)胞株對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的敏感性明顯增加。Survivin下調(diào)使黑色