小分子化合物木脂素VB6通過激活JNK信號通路誘導腫瘤細胞凋亡和自噬的機制研究.pdf

1、[研究背景]
　　 惡性腫瘤的發(fā)病率越來越高，且涉及機體各個系統(tǒng)，成為危害人類健康的常見病。目前，惡性腫瘤的治療仍然以手術治療為主，輔以化療、放療、生物治療的綜合性治療。近年來在腫瘤手術及放化療不斷發(fā)展的同時，分子靶向治療，腫瘤免疫治療也飛速發(fā)展。隨著臨床治療的多元化，腫瘤患者的臨床獲益得到改善，生存時間明顯延長。但是，在化療的過程中有相當部分患者因為對化療藥物耐藥或者難以耐受藥物的毒副反應而不能維持長期緩解，尋求高效低毒的藥物

2、仍是腫瘤治療研究的一個重要方向。
　　 黃荊子乙酸乙酯提取物(Evn-50)來源于黃荊子(FructusViticisNegundo)，其為馬鞭草科牡荊屬植物黃荊(VitexnegundoL.)的果實，黃荊子性溫，味苦，具有除痰，行氣，止痛，退熱，治療咳嗽，哮喘的功能，中醫(yī)主要用于治療慢性支氣管炎，對咳，痰，喘有明顯療效[1]。Evn-50是黃荊子的主要毒性成分，屬于新木脂素類化合物，同其他植物類木脂素化合相比，不需經(jīng)過腸道細菌

3、轉化成動物木脂素腸內酯、腸二醇。本課題組前期對Evn-50抗惡性腫瘤的作用進行了較系統(tǒng)的體外和體內的試驗研究，體外研究發(fā)現(xiàn)Evn-50具有較廣譜的抗惡性腫瘤作用，在體外對多種惡性腫瘤細胞系諸如MCF7、ZR-75-1、MDA-MB-435S、MDA-MB-231、LNCaP、PC-3、COC1細胞均有明顯的增殖抑制作用，荷瘤裸鼠模型的研究也表明，Evn-50同樣具有顯著的抑制乳腺癌，前列腺癌，肝癌模型和子宮頸癌生長的作用。研究發(fā)現(xiàn)Evn

4、-50通過顯著上調Bax/Bcl-2的比值，促進Bax的表達，抑制Bcl-2的表達而誘導細胞發(fā)生凋亡。上述實驗結果提示，天然小分子化合物Evn-50對多種惡性細胞具有明確的誘導凋亡作用。
　　 VB6又名6-羥基-4-(4-羥基-3-甲氧基苯基)3-羥甲基-7-甲氧基-3，4-二氫(3R，4S)-2-醛基萘，是從Evn-50化合物中分離純化出來的單體分子。本課題組繼續(xù)對VB6進行抗腫瘤活性研究，探討VB6體外體內抗腫瘤作用及其可

5、能機制，進一步從分子水平明確VB6對腫瘤相關信號通路的影響，為后續(xù)新型抗腫瘤藥物的研發(fā)奠定實驗基礎。
　　 [研究目的]
　　 篩選敏感細胞株，研究VB6在體外對腫瘤細胞的增殖抑制及促進凋亡、自噬作用，并探討其分子機制，明確其誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡、自噬的信號轉導途徑。同時建立大腸癌細胞株RKO裸鼠荷瘤模型，研究VB6的體內抗腫瘤作用。
　　 [研究方法]
　　 1.倒置顯微鏡觀察VB6處理MCF-7、RK

6、O細胞后的形態(tài)學改變；
　　 2.采用MTT法測定VB6對不同細胞株的生長抑制率，篩選敏感細胞株；
　　 3.透射電鏡觀察VB6處理MCF-7、RKO細胞后細胞凋亡、自噬形態(tài)改變；
　　 4.流式細胞儀分析凋亡細胞百分比及細胞周期改變；
　　 5.WesternBlot法檢測VB6處理MCF-7、RKO細胞后JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、p-Bcl-2、Caspase

7、-3、PARP、Beclin-1、LC3B的表達變化；
　　 6.Balb/c-nu雌性裸鼠荷瘤，腹腔給藥觀察VB6的體內抗腫瘤作用。
　　 [研究結果]
　　 1.VB6對MCF-7和RKO細胞增殖抑制效果隨著藥物作用時間延長和濃度增加而加強
　　 應用倒置顯微鏡觀察VB6對MCF-7和RKO細胞增殖的影響，經(jīng)過5μMVB6作用不同時間后，兩株細胞均可見細胞質減少，細胞體縮小，多數(shù)細胞由多邊形變成橢圓形

8、或者圓形，細胞伸展不良，逐漸與周圍的細胞脫離，還有明顯的空泡化，出現(xiàn)大量的細胞碎片，且形態(tài)改變隨作用時間的延長而變得明顯，不同濃度VB6對MCF-7和RKO細胞分別作用24、12小時后發(fā)現(xiàn)兩株細胞產(chǎn)生同樣的形態(tài)改變，高濃度更明顯。結果表明VB6對MCF-7和RKO細胞增殖都有較好的抑制作用，并且抑制效果表現(xiàn)出時間和濃度依賴性。
　　 2.不同類型的細胞株對VB6的敏感性不同
　　 人乳腺癌MCF-7細胞株IC50為1.4

9、6μM，人白血病K562細胞株IC50為1.32μM，人大腸癌RKO、SW480、SW620細胞株IC50分別為2.85μM、4.2μM、3.36μM，人膀胱癌HTB-95637、RT4細胞株IC50分別為2.85μM、3.92μM，人骨肉瘤MG63細胞株IC50為2.01μM，人肺癌H1975細胞株IC50為4.24μM，人肝癌HepG2細胞株IC50為12.37μM，人胰腺癌Panc-1細胞株IC50為7.62μM，人胃癌細胞株AG

10、S、MKN-28細胞株IC50分別為2.34μM、7.08μM，人前列腺癌PC-3細胞株IC50為1.71μM。
　　 3.VB6誘導MCF-7、RKO細胞出現(xiàn)凋亡和自噬形態(tài)改變
　　 5μMVB6作用MCF-7、RKO細胞24h后透射電鏡觀察結果顯示：細胞胞體體積縮小，胞質濃縮，線粒體空泡化，核內染色質濃縮，形成染色質塊，核碎片明顯，兩株細胞都出現(xiàn)了凋亡性死亡；透射電鏡下除見到凋亡改變外，還可觀察到細胞自噬的特征變化，

11、可見雙層膜結構的自噬泡積聚及膨脹的線粒體。
　　 4.VB6誘導MCF-7、RKO細胞凋亡呈濃度依賴性
　　 流式結果顯示：VB6可以引起MCF-7和RKO細胞凋亡，并且細胞凋亡率呈濃度依賴性。MCF-7細胞經(jīng)過1、2μMVB6處理細胞24h后，細胞的凋亡率分別是(6.15±1.07)％、(11.06±0.5)％，結果與對照組相比(p<0.05)。
　　 RKO細胞對照組凋亡率為2.51％，而經(jīng)過1、5μMVB6

12、處理細胞12h后，細胞凋亡率分別為10.75％、13.32％，結果同對照組相比均具有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。
　　 VB6聯(lián)合應用JNK特異性抑制劑SP600125處理MCF-7和RKO細胞相應時間后，兩種細胞凋亡率明顯受到抑制，同單用VB6相比，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 5.VB6可以引起MCF-7細胞G2/M期阻滯，并且細胞周期阻滯具有濃度依賴性
　　 應用流式細胞儀檢測VB6對MCF-7和RKO細胞周

13、期的影響，1，2μMVB6作用MCF-7細胞12小時G2/M期分別為17.51％、23.06％，明顯高于正常對照細胞的4.89％，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)；且2μMVB6作用MCF-7細胞24小時G2/M期細胞比率增加到50.24％。而流式結果分析，VB6對RKO細胞周期分布未見明顯影響。結果表明異VB6可以引起MCF-7細胞G2/M期阻滯，并且細胞周期阻滯具有時間和濃度依賴性。
　　 6.VB6通過引起B(yǎng)cl-2

14、和Bax表達變化，Caspase-3及PARP裂解激活，JNK通路活化誘導MCF-7和RKO細胞凋亡
　　 WesternBlot結果顯示：VB6誘導乳腺癌MCF-7和大腸癌RKO細胞凋亡伴有Bcl-2和Bax相對比例的改變，RKO細胞Caspase-3及PARP裂解激活；VB6能以濃度和時間依賴性方式上調MCF-7和RKO細胞p-JNK、p-c-Jun、p-Bcl-2蛋白質的表達水平而引起細胞凋亡。VB6聯(lián)合應用JNK特異性抑

15、制劑SP600125處理MCF-7和RKO細胞后明顯抑制p-JNK、p-e-Jun、p-Bcl-2蛋白質的表達水平，細胞凋亡比率受到明顯抑制。
　　 7.VB6誘導MCF-7和RKO細胞自噬同自噬蛋白Beclin-1、LC3B有關
　　 Beclin-1的激活可以促進自噬的發(fā)生，LC3B是酵母Atg8的同源物，是哺乳動物細胞自噬體形成的可靠標志。通過Westernblot方法檢測，結果顯示VB6可上調兩株細胞Beclin

16、-1的表達，同時伴隨有LC3B的裂解，呈時間依賴性。
　　 8.VB6對荷瘤裸鼠移植瘤生長的影響
　　 VB6對RKO細胞裸鼠移植瘤體積增長有抑制作用，同PBS組比較差異有顯著性(p<0.05)，但VB6各濃度組間RKO細胞裸鼠移植瘤體積無統(tǒng)計學差異；同時，各濃度VB6組裸鼠體重、精神狀態(tài)及尸檢時裸鼠肝臟、肺臟、心臟、腸等重要臟器顏色、形狀未見明顯異常，實驗劑量下VB6對裸鼠未見明顯毒副作用。
　　 [結論]

17、r>　　 1.VB6能有效抑制多種人源性腫瘤細胞增殖，具有明顯的細胞毒性作用，但細胞株類型不同，其敏感性不同；
　　 2.VB6能誘導MCF-7和RKO細胞凋亡，并且細胞凋亡率具有時間和濃度依賴性。能將MCF-7細胞周期阻滯在G2/M期；
　　 3.VB6能誘導MCF.7和RKO細胞自噬性死亡；
　　 4.VB6通過顯著上調Bax/Bcl-2的比值，促進Bax的表達，抑制Bcl-2的表達而誘導細胞發(fā)生凋亡；