靶向G-四鏈體的小分子化合物SYUIQ-5誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡及其機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的： 人端粒DNA由5’——3’重復(fù)序列和一個3’懸突端組成，富含鳥嘌呤重復(fù)序列的DNA鏈在一些小分子化合物的誘導(dǎo)下能夠形成G—四鏈體。 本文主要探討SYUIQ—5誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬的分子機(jī)制及自噬在其抗腫瘤中的作用。 研究方法： 用MTT法檢測SYUIQ—5對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用；免疫印跡法和RT—PCR法分別檢測蛋白和mRNA的表達(dá)；免疫熒光檢測蛋白定位；用MDC染色及YFP—LC3融

2、合蛋白檢測細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成；用shRNA干擾ATG5，建立ATG5敲除的穩(wěn)定細(xì)胞株；用siRNA干擾BNIP3，檢測BNIP3在SYUIQ—5誘導(dǎo)自噬過程中的作用；用分子克隆技術(shù)及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。 研究結(jié)果： 1、SYUIQ—5對CNE2、HeLa、SW620細(xì)胞體外增殖活性的影響 為了測定SYUIQ—5對腫瘤細(xì)胞體外增殖活性的影響，我們用0.31μg/ml—5μg/ml的SYUIQ

3、—5處理CNE2、HeLa、SW620細(xì)胞3天，計(jì)算SYUIQ—5對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，可見呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，其IC50值分別為0.93μg/ml、0.55μg/ml、0.20μg/ml。結(jié)果顯示SYUIQ—5在體外能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖活性。 2、SYUIQ—5誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬 2.1 SYUIQ—5對腫瘤細(xì)胞中LC3-Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)化的影響 多種腫瘤細(xì)胞在SYUIQ—5處理后，Western blot檢

4、測可見LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)均有增加，LC3-Ⅱ較LC3-Ⅰ表達(dá)更強(qiáng)，增加更明顯。RT—PCR顯示LC3在mRNA水平也有所增強(qiáng)，說明SYUIQ—5處理后能在轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)LC3的表達(dá)。表明SYUIQ—5能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，且上調(diào)LC3的表達(dá)。 2.2 SYUIQ—5誘導(dǎo)自噬體形成 Monodansylcadaverine是一種熒光染料，可與細(xì)胞內(nèi)的酸性囊泡結(jié)合，被用作自噬泡的示蹤劑，但MDC并不是自噬泡的特

5、異標(biāo)志物。SYUIQ—5處理后MDC染色增強(qiáng)并呈點(diǎn)狀化分布。隨后，我們又用免疫熒光觀察到在SYUIQ—5處理的細(xì)胞中，YFP—LC3融合蛋白的黃色熒光從均勻分布變?yōu)辄c(diǎn)狀聚集，YFP—LC3的聚集被認(rèn)為是自噬體形成的特異性標(biāo)志。為了定量自噬發(fā)生的強(qiáng)度，我們計(jì)算了YFP—LC3陽性細(xì)胞的比例。以每個細(xì)胞中YFP—LC3焦點(diǎn)數(shù)≥5為陽性細(xì)胞，其比例在對照組的CNE2和HeLa細(xì)胞中分別為21.1％和15.9％，而在SYUIQ—5處理組分別達(dá)到

6、71.7％和67.2％。 3、SYUIQ—5對端粒結(jié)合蛋白的影響 3.1 SYUIQ—5對端粒結(jié)合蛋白TRF1、TRF2表達(dá)水平的影響 用0.5-4μg/ml的SYUIQ—5作用CNE2和HeLa細(xì)胞48小時后，Western blot檢測各蛋白表達(dá)。結(jié)果可見TRF2隨著SYUIQ—5濃度的增加表達(dá)減少，TRF1在這一過程中無明顯改變。為了檢測以上端粒結(jié)合蛋白的改變是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平還是轉(zhuǎn)錄后水平，我們用同上的方法

7、處理細(xì)胞后用RT—PCR法檢測其mRNA水平。TRF1和TRF2的mRNA均無明顯變化，說明TRF2的改變發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。 3.2 SYUIQ—5處理前后TRF2在細(xì)胞中的定位 用免疫熒光雙染法觀察TRF2在SYUIQ—5處理前后在細(xì)胞中的定位。以TRF1作為端粒的標(biāo)志，對照組中，TRF2蛋白表達(dá)豐富且絕大部分與TRF1共定位，在SYUIQ—5處理24h的細(xì)胞中，TRF2表達(dá)減少且與TRF1位點(diǎn)分離。說明作為G—四鏈體

8、配體的SYUIQ—5能使端粒結(jié)合蛋白TRF2從端粒解離。 TRF2在SYUIQ—5處理過程中顯著減少，為了探究其減少的原因，我們聯(lián)合蛋白酶體抑制劑MG-132處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，MG-132能使SYUIQ—5引起的TRF2減少得到恢復(fù)，說明SYUIQ—5在促使TRF2從端粒結(jié)合位點(diǎn)解離后被蛋白酶體水解，從而使端粒失去了TRF2的保護(hù)。 4、SYUIQ—5引起端粒DNA損傷 4.1 SYUIQ—5誘導(dǎo),γ—H2AX表

9、達(dá)增高 當(dāng)用0.5-4μg/ml的SYUIQ—5處理CNE2和HeLa細(xì)胞48h后，Western blot檢測可見γ—H2AX表達(dá)隨用藥濃度的增高而增強(qiáng)，說明SYUIQ—5能引起DNA雙鏈斷裂。免疫熒光也可見到在SYUIQ—5處理的細(xì)胞中，γ—H2AX聚集形成的焦點(diǎn)數(shù)明顯增多。同時，我們計(jì)數(shù)了γ—H2AX陽性細(xì)胞的比例。對照組中的γ—H2AX陽性細(xì)胞比例在CNE2和HeLa細(xì)胞分別為9.7％和9.2％，而在SYUIQ—5處理組

10、中分別為77.5％和90.7％。 4.2 SYUIQ—5誘導(dǎo)的,γ—H2AX與TRF1共定位 SYUIQ—5能引起γ—H2AX表達(dá)增加，說明DNA發(fā)生了損傷。那么其損傷是發(fā)生在全基因組DNA還是具有位點(diǎn)特異性呢？用免疫熒光雙染法檢測γ—H2AX在細(xì)胞中的定位，仍然用TRF1作為端粒的標(biāo)志，可見SYUIQ—5處理后，γ—H2AX的綠色熒光大部分與TRF1的紅色熒光重疊，說明SYUIQ—5能特異性地引起端粒DNA損傷。

11、 4.3 TRF2過表達(dá)對SYUIQ—5誘導(dǎo)DNA損傷及自噬的影響 為了說明TRF2在SYUIQ—5引起的DNA損傷及自噬反應(yīng)中的作用，我們看到在瞬時轉(zhuǎn)染外源性TRF2使其高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，γ—H2AX的表達(dá)下調(diào)，且LC3的蛋白水平也有所降低；而轉(zhuǎn)染突變型TRF2ΔBΔM的細(xì)胞，γ—H2AX和LC3表達(dá)均上調(diào)，說明野生型TRF2高表達(dá)能抑制SYUIQ—5引起的DNA損傷反應(yīng)和自噬的發(fā)生。另外，我們還篩選出TRF2穩(wěn)定表達(dá)的

12、細(xì)胞株，MTT結(jié)果可見，與轉(zhuǎn)染載體的對照組相比，TRF2高表達(dá)細(xì)胞在SYUIQ—5的處理下，其增殖能力和細(xì)胞活性較強(qiáng)，進(jìn)一步說明TRF2高表達(dá)能對抗SYUIQ—5的細(xì)胞毒作用。 4.4 SYUIQ—5誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)和自噬依賴于ATM的激活 SYUIQ—5處理后，ATM被激活發(fā)生磷酸化。當(dāng)用ATM的抑制劑CGK733抑制了ATM的活性后，γ—H2AX的表達(dá)也隨之減少。說明SYUIQ—5誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)至少是部分

13、依賴于ATM激活的。當(dāng)用CGK733與SYUIQ—5聯(lián)合作用于細(xì)胞時，能減弱SYUIQ—5對細(xì)胞增殖活性的抑制作用，更進(jìn)一步說明ATM的激活在SYUIQ—5引起的DNA損傷反應(yīng)中起重要作用。同時，我們發(fā)現(xiàn)ATM活性被抑制后，LC3-Ⅱ表達(dá)下降，表明自噬被阻斷。 5、SYUIQ—5抑制Akt磷酸化誘導(dǎo)FOXO3a核移位 用不同濃度的SYUIQ—5處理CNE2細(xì)胞48小時后，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)p—Akt蛋白表達(dá)

14、水平明顯下降，并呈劑量依賴性，而總的Akt在這一過程中無明顯變化。 用0.1％DMSO和3.0μg/ml的SYUIQ—5分別作用CNE2細(xì)胞24h后，在共聚焦顯微鏡下觀察FOXO3a在用藥前后在細(xì)胞中的定位。結(jié)果表明，對照組FOXO3a主要在胞漿中分布，SYUIQ—5處理組則顯示FOXO3a集中分布在胞核中。 6、SYUIQ—5對自噬相關(guān)蛋白的影響 用0.25-2μg/ml的SYUIQ—5分別處理CNE2、CNE

15、1和HONE1細(xì)胞48h，0.1％的DMSO為對照，Western blot檢測可見BNIP3蛋白表達(dá)水平隨藥物濃度的增加而增加，而mRNA無明顯變化。在CNE2細(xì)胞中Beclinl無明顯改變。 用siRNA干擾BNIP3，24h后再分別用0.1％DMSO或SYUIQ—5處理CNE2細(xì)胞24h。Western blot顯示BNIP3表達(dá)下調(diào)后，LC3-Ⅱ的表達(dá)也明顯減弱，說明BNIP3在SYUIQ—5誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬中起著重要作用

16、。 7、N—乙酰半胱氨酸抑制SYUIQ—5誘導(dǎo)自噬 ROS是真核細(xì)胞有氧呼吸時的產(chǎn)物，包括超氧陰離子、過氧化氫等。ROS可介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活轉(zhuǎn)錄因子，促使基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞生長、增殖和凋亡，發(fā)揮重要生物學(xué)效應(yīng)。ROS也可介導(dǎo)自噬的產(chǎn)生。用抗氧化劑NAC拮抗細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，能部分抑制LC3-Ⅱ的表達(dá)，即抑制了自噬的發(fā)生。因此，刺激細(xì)胞產(chǎn)生活性氧自由基而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬可能是SYUIQ—5誘導(dǎo)CNE2細(xì)胞發(fā)生自噬的機(jī)制

17、之一。 8、SYUIQ—5誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡 hp—2和hp—7是針對ATG5的兩條shRNA序列。為了明確自噬的發(fā)生在SYUIQ—5介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用，我們建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shATG5的CNE2和HeLa細(xì)胞，ATG5表達(dá)顯著下調(diào)，SYUIQ—5誘導(dǎo)的自噬作用也受到阻礙。MTT顯示，在轉(zhuǎn)染shATG5的CNE2和HeLa細(xì)胞中，SYUIQ—5促進(jìn)細(xì)胞死亡和抑制生長的作用明顯減弱，說明SYUIQ—5通過誘導(dǎo)自噬促