鞣花酸對3T3-L1細胞成脂作用的影響及機理研究.pdf

1、目的：按照轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的理念，本項研究擬以肥胖為切入點，開展脂肪細胞成脂過程研究，探索干預(yù)成脂的靶點。故本文旨在通過調(diào)查新疆維吾爾族和哈薩克族人群中心性肥胖患病率，確定肥胖的切入點；并在3T3-L1前體脂肪細胞模型中觀察鞣花酸對脂肪形成的作用，并探討其機制。試圖將肥胖這一臨床表象與成脂的基礎(chǔ)研究相結(jié)合，為防治代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展提供新的干預(yù)靶點，并為開發(fā)新疆地產(chǎn)石榴皮作為減肥植物資源提供可能的實驗依據(jù)。
　　方法：根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，

2、納入1,379名維吾爾族和1,123名哈薩克族志愿者，年齡30～70歲，禁食8～12小時后，采集血液，并進行體征指標(biāo)測量和生化指標(biāo)檢測。觀察兩民族中心性肥胖患病率。數(shù)據(jù)處理采用χ2檢驗及t-檢驗，用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理。為觀察鞣花酸在3T3-L1脂肪前體細胞系中對終末成脂的影響，我們采用以下方法：用臺盼藍活細胞拒染實驗觀察鞣花酸對脂肪細胞活力的影響；WST-1染色和細胞計數(shù)法觀察誘導(dǎo)前后3T3-L1前體脂肪細胞的增

3、殖；PI和ANNEXIN-V雙染觀察鞣花酸對誘導(dǎo)前后3T3-L1前體脂肪細胞凋亡的影響；Oil red O染色觀察鞣花酸對生脂激素及促有絲分裂復(fù)合物（三甲基異丁基黃嘌呤、地塞米松和胰島素）作用下3T3-L1脂肪前體細胞脂肪形成的影響；在誘導(dǎo)不同時間段加入鞣花酸，Oil red O染色觀察鞣花酸影響脂肪形成的最佳作用時間窗；western blott法檢測細胞周期相關(guān)蛋白（cyclinA，CDK2，phospho-Rb/total-Rb和

4、C/EBPβ及C/EBPβThr188磷酸化）以及脂肪細胞特異性蛋白（C/EBPα，PPARγ和aP2）的表達，初步探討鞣花酸影響脂肪形成的作用機制；PI單染流式細胞術(shù)觀察誘導(dǎo)后24小時內(nèi)，鞣花酸對3T3-L1脂肪前體細胞細胞周期進程的影響；EdU和Hoechst33342雙染熒光顯微鏡下觀察進入S期細胞的數(shù)量，進一步驗證鞣花酸對細胞周期進程的作用；提取3T3-L1脂肪前體細胞核蛋白用TRANS Active Motif ELISA試劑

5、盒檢測鞣花酸對C/EBPβ和C/EBPαDNA結(jié)合活性的影響；Luciferase雙熒光素酶報告基因法檢測鞣花酸對C/EBPβ轉(zhuǎn)錄激活的作用；最后用Realtime PCR和western blott檢測C/EBPβ靶基因和靶蛋白的表達，進一步闡述鞣花酸對 C/EBPβ轉(zhuǎn)錄激活作用的影響。數(shù)據(jù)處理采用方差分析及t-檢驗，用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理。
　　結(jié)果：維吾爾族和哈薩克族中心性肥胖患病率為51.6％和50.

6、8%，差異無顯著性。均衡年齡和性別后，維吾爾族高甘油三酯血癥患病率高于哈薩克族，分別為53.6%和24.1%（P＜0.05），而高密度脂蛋白減低血癥患病率也高于哈薩克族，分別為49.1%和12.1%（P＜0.05）。鞣花酸不影響3T3-L1脂肪前體細胞活力；與對照組相比可時間-濃度依賴性地抑制誘導(dǎo)前后前體脂肪細胞增殖；鞣花酸對生脂激素及促有絲分裂復(fù)合物誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的3T3-L1脂肪前體細胞均無促凋亡作用；但鞣花酸可濃度依賴的抑制3T3

7、-L1脂肪細胞脂肪形成，抑制脂肪形成主要通過影響脂肪形成的早期發(fā)揮作用；鞣花酸抑制細胞周期相關(guān)蛋白（cyclinA，phospho-Rb/total-Rb和C/EBPβ Thr188磷酸化）的表達，對 CDK2，C/EBPβ總蛋白表達無影響；鞣花酸也抑制脂肪細胞特異性蛋白（C/EBPα，PPARγ和aP2）的表達；另外，鞣花酸可時間-濃度依賴地抑制進入 S期的3T3-L1脂肪前體細胞數(shù)量，將3T3-L1脂肪前體細胞阻滯在G1期；實驗結(jié)果

8、還發(fā)現(xiàn)鞣花酸抑制生脂激素及促有絲分裂復(fù)合物誘導(dǎo)后24h C/EBPβ和以及36h和48h的C/EBPαDNA結(jié)合活性；Luciferase雙熒光素酶報告基因法揭示鞣花酸可抑制C/EBPβ轉(zhuǎn)錄激活活性；并且抑制 C/EBPβ靶基因（C/EBPα和PPARγ）和靶蛋白（C/EBPα和PPARγ）的表達，更進一步證明鞣花酸抑制C/EBPβ轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　結(jié)論：新疆維吾爾和哈薩克族肥胖患病率高，且合并脂代謝紊亂，這可能是導(dǎo)致代謝性疾病