體外不同培養(yǎng)時(shí)間影響CD3-CD56+NK細(xì)胞數(shù)量及活性變化的研究.pdf

1、背景
　　 19世紀(jì)80年代興起的細(xì)胞過(guò)繼免疫治療帶給了腫瘤患者一個(gè)新的希望。自然殺傷(natural killer.NK)細(xì)胞作為機(jī)體抗腫瘤的第一道防線，再加上其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用是由其表面抑制性受體和活化性受體的共同信號(hào)決定，所以NK細(xì)胞成為近年細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的研究熱點(diǎn)。但NK細(xì)胞在外周血中的數(shù)量有限且在體外難以培養(yǎng)，所以NK細(xì)胞的體外培養(yǎng)就成為一項(xiàng)影響NK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療臨床療效的關(guān)鍵步驟，影響NK細(xì)胞的培養(yǎng)因素眾多，

2、而培養(yǎng)時(shí)間是一個(gè)基本的但又不可避免的影響因素。近年來(lái)多項(xiàng)研究提示異體半相合NK細(xì)胞在造血干細(xì)胞移植和過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療方面均顯示出對(duì)人類血液系統(tǒng)腫瘤的積極治療作用，但自體NK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的臨床效果卻不能令人滿意。這就促使我們對(duì)異體（通常是健康人群）NK細(xì)胞培養(yǎng)后的細(xì)胞數(shù)量（細(xì)胞存活率、NK細(xì)胞的百分率和T細(xì)胞的百分率）及活性（NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞和RPIM8226細(xì)胞的殺傷活性）變化與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行充分的了解；以及健康人群與A

3、ML患者NK細(xì)胞培養(yǎng)后的細(xì)胞數(shù)量（細(xì)胞存活率、NK細(xì)胞的百分率和T細(xì)胞的百分率）及活性（NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞和RPIM8226細(xì)胞的殺傷活性）的差異進(jìn)行充分的了解。
　　 目的
　　 探討健康人群NK細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中隨培養(yǎng)時(shí)間的變化，細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞存活率、NK細(xì)胞的百分率、T細(xì)胞的百分率及NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞和RPIM8226細(xì)胞的殺傷活性的變化，確定健康人群NK細(xì)胞的最佳培養(yǎng)時(shí)間；同時(shí)與AML患者NK細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中

4、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞存活率、NK細(xì)胞的百分率和T細(xì)胞的百分率及對(duì)K562細(xì)胞和RPIM8226細(xì)胞的殺傷活性的變化的進(jìn)行比較，明確兩者之間的差異。為異體NK細(xì)胞免疫治療更好的應(yīng)用于臨床做準(zhǔn)備。
　　 方法
　　 1.采取10例健康志愿者和山西省腫瘤醫(yī)院血液科10例AML患者外周血15ml，運(yùn)用常規(guī)單個(gè)核細(xì)胞提取法提取單個(gè)核細(xì)胞，分別放于含有SCGM培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中培養(yǎng)，前Sd加入0.5ulCD3McAb，在培養(yǎng)的第Sd，倒掉含

5、有CD3McAb的培養(yǎng)液，加入含有rhIL-2的SCGM培養(yǎng)基。隔日補(bǔ)充一次培養(yǎng)液，直至第25d。
　　 2.運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)培養(yǎng)第0d、5d、10d、15d、20d及第25d的細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞存活率。
　　 3.運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)第0d、5d、10d、15d、20d及25d細(xì)胞中的NK細(xì)胞百分率和T細(xì)胞百分率。
　　 4.采用比色法檢測(cè)培養(yǎng)第0d、5d、10d、15d、20d及25d分選出的NK細(xì)胞對(duì)K56

6、2細(xì)胞和RPMI8226細(xì)胞的殺傷活性。
　　 結(jié)論
　　 1.總細(xì)胞和NK細(xì)胞的數(shù)量、NK細(xì)胞的百分率、NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞和RPMI8226細(xì)胞的殺傷活性與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)；T細(xì)胞的百分率與培養(yǎng)時(shí)間程負(fù)相關(guān)。也就是說(shuō)，NK細(xì)胞的數(shù)量及活性在一定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。
　　 2.健康志愿者和AML患者相比，總細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)的第20d開(kāi)始出現(xiàn)顯著性差異；NK細(xì)胞的百分率在培養(yǎng)的第10d開(kāi)始出現(xiàn)顯著

7、性差異；NK細(xì)胞對(duì)RPMI8226的殺傷活性在培養(yǎng)的第15d開(kāi)始出現(xiàn)顯著性差異；細(xì)胞存活率、T細(xì)胞的百分率、NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性在培養(yǎng)期間沒(méi)有出現(xiàn)顯著性差異。健康志愿者的NK細(xì)胞培養(yǎng)之后優(yōu)于AML患者的NK細(xì)胞。
　　 3.健康志愿者的NK細(xì)胞在培養(yǎng)的第20d，總細(xì)胞和NK細(xì)胞的數(shù)量、NK細(xì)胞的百分率、NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞和RPMI8226細(xì)胞的殺傷活性均達(dá)到最佳狀態(tài)，故健康志愿者即健康人群NK細(xì)胞的最佳培養(yǎng)時(shí)間間