結(jié)核分枝桿菌Rv1272和Rv1273蛋白的功能研究.pdf

1、目的：探索結(jié)核分枝桿菌Rv1272和Rv1273基因編碼蛋白與藥物外排的關(guān)系及研究其物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能,為探討結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)支持。
　　 方法：利用生物信息學(xué)方法分析Rv1272和Rv1273基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu),采用PCR技術(shù)擴(kuò)增這兩個(gè)基因,并與pMF406質(zhì)粒連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,測序正確后,電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌mc2155。同時(shí)用pMF406空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入mc2155做對(duì)照。對(duì)這兩個(gè)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位

2、后,用試管法測定其對(duì)常用的九種抗菌藥物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。另一方面,用530nm激發(fā)光和590nm散射光,顯示菌體對(duì)溴化乙錠(Ethidium bromide,EB)吸收的量,判斷這兩個(gè)基因是內(nèi)排還是外排EB。然后構(gòu)建菌株pMF-ΔRv1273,進(jìn)一步驗(yàn)證這兩個(gè)基因的功能。最后通過檢測菌株生長對(duì)EB的敏感性,進(jìn)一步驗(yàn)證其功能。
　　 結(jié)果：經(jīng)驗(yàn)證Rv1272

3、和Rv1273為膜蛋白。通過測定發(fā)現(xiàn)與對(duì)照菌株相比,含有這兩個(gè)基因的重組菌株對(duì)所測藥物的MIC無顯著性差異,未發(fā)現(xiàn)膜蛋白R(shí)v1272和Rv1273在重組菌株中對(duì)所測藥物的外排作用。與對(duì)照菌株相比,菌株pMF406-Rv1272對(duì)EB的吸收沒有顯著變化。而菌株pMF406-Rv1273 EB的吸收量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照菌株,菌株pMF-ΔRv1273與對(duì)照菌株EB吸收量基本接近。在大腸桿菌和恥垢分枝桿菌中,含有Rv1272和Rv1273重組質(zhì)粒的