miR-21-4T1細胞的構建及其exosome功能的初步研究.pdf

1、目的:microRNA-21(miR-21)是一種在多種實體瘤中高表達的microRNA，包括乳腺癌，它參與并促進腫瘤的發(fā)生、進展。細胞中的microRNA可以分泌到exosome中去。Exosome是一種細胞分泌的膜性納米小泡。腫瘤分泌的exosome可以通過自分泌方式促進腫瘤細胞的生長，通過旁分泌或者是內(nèi)分泌方式抑制免疫監(jiān)視、促進腫瘤細胞的轉移，為其生長和進展提供一個有利的環(huán)境。為了進一步探討miR-21是否會通過釋放的exosom

2、e影響腫瘤微環(huán)境，進而影響腫瘤細胞的生長、轉移，本實驗構建了高表達miR-21的4T1細胞株，初步探究其分泌的exosome對腫瘤細胞以及免疫細胞的影響。
　　方法:
　　1.構建穩(wěn)定高表達miR-21的4T1細胞株利用慢病毒載體構建高表達miR-21的4T1細胞株即miR-21-4T1細胞株，通過實時定量PCR驗證該穩(wěn)轉株中miR-21的過表達，熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測miR-21-4T1細胞中綠色熒光蛋白表達情況。同時

3、構建空載體對照scramble-4T1細胞。
　　2.miR-21對4T1生物性狀的影響通過細胞增殖活力實驗（MTS方法）、劃痕實驗及Transwell細胞遷移實驗分別觀察miR-21升高后對4T1細胞增殖、遷移能力的影響。
　　3.exosome的制備收集72小時體外培養(yǎng)miR-21-4T1細胞的上清，差速離心法分離提取exosome:300×g，10分鐘;2000×g，20分鐘;10000×g，30分鐘;然后將上清超高速

4、100000×g離心120分鐘。最后用磷鎢酸負染exosome并在透射電子顯微鏡下觀察exosome的形態(tài)。
　　4.miR-21-4T1細胞分泌的exosome功能研究實時定量PCR的方法檢測來自miR-21-4T1細胞的exosome中miR-21的相對表達情況。MTS實驗、劃痕實驗、Transwell細胞遷移實驗分別觀察miR-21-4T1所分泌的exosome對4T1細胞增殖、遷移能力的影響;采用ELISA試劑盒分析其對小

5、鼠腹腔巨噬細胞、小鼠骨髓來源的DC細胞分泌IL-6、IL-10的影響;流式細胞術分析其對小鼠骨髓來源的DC細胞表面分子MHCⅡ、CD86、CD54表達的影響。
　　結果:
　　1.實時定量PCR結果顯示，利用慢病毒載體構建的miR-21-4T1細胞中miR-21表達水平升高了2.79±0.5411倍。熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)miR-21-4T1、scramble-4T1細胞中幾乎均帶有綠色熒光，同樣流式細胞術檢測的miR-21-4T

6、1、scramble-4T1細胞中綠色熒光蛋白表達率分別能夠達到93.58％±0.456、77.06％±0.844。
　　2.MTS結果顯示miR-21-4T1細胞與4T1細胞增殖能力沒有顯著性差異，但在劃痕實驗和Transwell細胞遷移實驗中，miR-21-4T1細胞遷移能力要高于4T1和scramble-4T1細胞。
　　3.利用差速離心方法得到的miR-21-4T1細胞分泌的exosome，通過磷鎢酸負染在透射電子顯

7、微鏡下觀察到直徑約在40-100nm的橢圓形顆粒，中間淡染，邊緣深染。
　　4.經(jīng)實時定量PCR檢測分析后發(fā)現(xiàn)，miR-21-4T1細胞分泌的exosome中miR-21表達水平增加了3.49±0.2703倍。
　　5.在增殖實驗和劃痕實驗中，miR-21-4T1分泌的exosome與對照組沒有明顯的差異。但在Transwell細胞遷移實驗中，它所分泌的exosome能夠促進4T1細胞遷移。
　　6.miR-21-4T

8、1分泌的exosome可以促進小鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-6、IL-10，但是該功能弱于4T1細胞的exosome，且這種作用不受TLR7受體阻斷劑所影響。
　　7.miR-21-4T1來源的exosome可以促進小鼠骨髓來源樹突狀細胞分泌IL-6、IL-10，減少小鼠骨髓來源樹突狀細胞表面的MHCⅡ分子表達。
　　結論:
　　1.過表達的miR-21可以促進4T1細胞的轉移能力。
　　2.4T1細胞中的miR-2