版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、p53基因是一種非常重要的抑癌基因,人類p53基因位于17號染色體的短臂上(17p13.1),現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它在細胞周期調(diào)控、抑制細胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等方面有重要的作用.p53基因的突變和缺失,是許多腫瘤發(fā)生的重要原因之一.p53基因不僅與腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系,而且與腫瘤血管調(diào)控、腫瘤細胞對放療和化療的敏感性等方面有著重要聯(lián)系.p53基因的這些生物學(xué)效應(yīng)主要通過激活或抑制大量下游基因的表達來完成,但p53與多種基因之間存在的具體調(diào)節(jié)機
2、制尚不明確. 在功能基因組研究中,需要對特定基因進行功能喪失或突變.以確定其功能或與其它基因之間的聯(lián)系.RNA干擾(RNA interfererme,RNAi)是近幾年發(fā)展起來的一種特異的靶基因失活技術(shù),它通過小的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因的表達,促使mRNA降解,誘使細胞出現(xiàn)缺失特定基因表型的過程.由于RNAi高度的序列專一性,可以特異地使特定基因沉默,在眾多有機體中,
3、雙鏈RNA能觸發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默,因而成為敲除特定基因在哺乳動物細胞系中表達的有力工具. 在哺乳動物中通過RNAi機制實現(xiàn)基因表達的抑制有多種策略,其中以構(gòu)建siRNA(small intereference RNA)表達載體的方法最為穩(wěn)定和持久.本研究特異性針對p53基因來設(shè)計并構(gòu)建能抑制此基因的RNA干擾載體,把干擾載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入胃癌細胞SGC-7901,從基因水平和蛋白水平檢測此干擾載體的抑制效率,并觀察抑制p53基因的表達
4、對胃癌細胞SGC-7901的生長影響.根據(jù)文獻p53SiRNA序列<'[3]>,設(shè)計并化學(xué)合成2段編碼短發(fā)夾RNA序列的、靶向p53基因的寡核苷酸,退火,克隆到經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后的siRNA表達載體--pSIIPER-EGFPl(pSG)啟動子的下游,重組構(gòu)建RNAi質(zhì)粒,同時設(shè)立非特異性對照,干擾載體用限制性核酸內(nèi)切酶酶切和測序鑒定,構(gòu)建好的干擾載體轉(zhuǎn)染胃癌細胞SGC-7901,用G418篩選建立穩(wěn)定細胞系,通過RT-PCR和W
5、estern blot檢測其對p53基因的抑制效果,并利用流式細胞儀檢測細胞生長周期和作細胞生長曲線的方法觀察抑制p53基因的表達對胃癌細胞SGC-7901的生長影響. 結(jié)果 經(jīng)HindⅢ和EcoR I雙酶切電泳分析以及插入基因的序列分析證實:我們設(shè)計的堿基序列成功插入到了預(yù)計位點,一個特異性針對p53基因的干擾載體pSiJPER-EGFPl-p53i(pSG-p53i)構(gòu)建成功.同時,我們也構(gòu)建了一個非特異性干擾載體p
6、SIJPER-EGFPl-p53c(pSG-p53c)作為對照. 分別將pSG-p53i和IpSG-p53c轉(zhuǎn)染入胃癌細胞SGC-7901建立穩(wěn)定細胞系,用RT-PCR檢測p53基因mRNA表達變化,其結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染了pSG-p53i的胃癌細胞其p53mRNA的表達水平顯著低于非特異對照,經(jīng)BandScan V5.0軟件分析得到mRNA表達的抑制率為62﹪:用Western blot檢測p53基因蛋白表達變化,其結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染了
7、pSG-p53i的胃癌細胞其p53基因蛋白表達量顯著低于非特異對照. 利用流式細胞儀檢測細胞生長周期,其結(jié)果為:轉(zhuǎn)染了pSG-p53i的胃癌細胞相比對照細胞其Gl期細胞減少了24.2﹪,S期細胞增加了81.0﹪,G2期細胞減少了77.9﹪.作轉(zhuǎn)染了pSG-p53i的胃癌細胞和轉(zhuǎn)染了:pSG-p53c的胃癌細胞的細胞生長曲線圖,生長曲線圖顯示:與對照細胞相比,轉(zhuǎn)染了pSG-p53i細胞的生長曲線發(fā)生了一定程度的左移.成功的構(gòu)建了能
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 44065.馬爾尼菲青霉rhogtpase激活因子rna干擾載體的構(gòu)建及其功能初步研究
- 隨機RNA文庫的構(gòu)建及其初步應(yīng)用.pdf
- actin參與P53功能調(diào)節(jié)的初步探討.pdf
- p53及其異構(gòu)體Δ113p53-Δ133p53的功能機制研究和體外染色體免疫共沉淀技術(shù)的構(gòu)建.pdf
- 重癥肝炎相關(guān)基因hfg12表達質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及其體外RNA干擾的初步研究.pdf
- RNA干擾草莓DHAR基因的初步研究.pdf
- 非編碼RNA克隆分析及其功能初步研究.pdf
- 葡萄病毒A MP基因RNA干擾載體的構(gòu)建及其鑒定.pdf
- SARS-CoV核衣殼蛋白的功能研究及RNA干擾的初步應(yīng)用.pdf
- RNA干擾研究p8-coml基因在肝細胞癌中的功能.pdf
- RNA干擾GCase對α-突觸核蛋白的影響及其機制的初步研究.pdf
- RNA干擾載體活體內(nèi)耳轉(zhuǎn)染初步研究.pdf
- 人多肽:N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2(ppGalNAc-T2)RNA干擾載體的構(gòu)建及其功能的初步研究.pdf
- PLIM參與p53功能調(diào)控及其分子機制研究.pdf
- 核苷酸切除修復(fù)基因XPB反義RNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能的初步研究.pdf
- Dicer切割7SL RNA及其切割產(chǎn)物的初步功能研究.pdf
- 用于RNA干擾的質(zhì)粒載體的構(gòu)建及檢測.pdf
- 重型肝炎相關(guān)基因的RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及其體內(nèi)外干預(yù)效應(yīng)的研究.pdf
- G蛋白偶聯(lián)受體激酶5與p53的相互作用及其對p53功能影響的研究.pdf
- 肝靶向性RNA干擾載體的構(gòu)建與鑒定.pdf
評論
0/150
提交評論