miR-128慢病毒載體的構(gòu)建及其在膠質(zhì)瘤中的功能研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的35～60％，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、病死率高和治愈率低的特點(diǎn)。膠質(zhì)瘤分化差、浸潤性強(qiáng)，導(dǎo)致手術(shù)切除困難，盡管手術(shù)輔以放化療對(duì)提高生存率有一定的作用，但由于膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因此治療效果有限。因此需要對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步深入研究和尋找針對(duì)膠質(zhì)瘤新的治療策略。
　　隨著miRNAs的發(fā)現(xiàn)及其在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制不斷深入研究，miRNAs在膠質(zhì)瘤中的調(diào)控作用越來越受到重

2、視，它能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長，在體內(nèi)發(fā)揮著類似于癌基因和抑癌基因的作用。其中miR-128為腦組織富含，在膠質(zhì)瘤中表達(dá)降低，在膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制中起到了類似于抑癌基因的作用。我們希望通過慢病毒介導(dǎo)的方法，提高miR-128在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，研究其高表達(dá)后對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的影響，為膠質(zhì)瘤的基因治療尋找新的治療途徑。
　　目的：在大樣本腦膠質(zhì)瘤組織中檢測(cè)miR-128情況，構(gòu)建含miR-128-1和miR-128-2前體的慢病毒表

3、達(dá)載體，包裝慢病毒，建立能夠穩(wěn)定表達(dá)目的基因的人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株。研究miR-128對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞功能影響。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為三部分：1.選取了在西京醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮膠質(zhì)瘤組織和正常減壓切除腦組織，膠質(zhì)瘤組織經(jīng)常規(guī)和免疫病理檢查確定膠質(zhì)瘤級(jí)別。提取總RNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA在各級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，以明確大樣本中miR-128的表達(dá)是否為低表達(dá)。2.擴(kuò)增hsa-miR-128的前體片段，與pENTR3C同時(shí)經(jīng)

4、過BamHI和XhoI雙酶切，使用T4DNA連接酶連接入pENTR3C質(zhì)粒中，測(cè)序正確后，利用LRclonaseⅡ酶將目的片段轉(zhuǎn)接于Plenti6.3質(zhì)粒，再次測(cè)序驗(yàn)證。構(gòu)建好的質(zhì)粒與PMD2.G、psPAX2兩個(gè)輔助質(zhì)粒使用脂質(zhì)體2000導(dǎo)入293T細(xì)胞，包裝出慢病毒。同時(shí)進(jìn)行慢病毒滴度測(cè)定。3.將包裝好的慢病毒感染人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，使用Bsd篩選高表達(dá)miR-128的人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株，與未感染U87細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)行MTT和流

5、式細(xì)胞檢測(cè)，明確細(xì)胞增殖方面的改變。
　　結(jié)果：經(jīng)大樣本臨床標(biāo)本檢測(cè)，miR-128在膠質(zhì)瘤中表達(dá)比正常腦組織降低，高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)低于低級(jí)別膠質(zhì)瘤。成功構(gòu)建重組慢病毒載體Plenti6.3-miR-128-1和Plenti6.3-miR-128-2，經(jīng)Blasticidin篩選細(xì)胞株、mCherry熒光表達(dá)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，成功包裝出慢病毒。病毒滴度測(cè)定在1.1×107-8.3×107TU/mL之間，細(xì)胞周期和MTT