梅毒螺旋體膜脂蛋白Tp0663、Tp0821、Tp0971通過TLR2途徑誘導巨噬細胞產生前炎癥細胞因子.pdf

1、目的：探討梅毒螺旋體（Treponema pallidum, Tp）膜脂蛋白 Tp0663、Tp0821、Tp0971能否誘導巨噬細胞產生前炎癥細胞因子（CKs）IL-6和IL-1β；通過觀察 TLR2抗體、CD14抗體、NF-κB特異抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)對三種膜脂蛋白誘導巨噬細胞產生CKs的影響，研究這些膜脂蛋白誘導產生前炎癥CKs是否與TLR2、CD14及NF-κB介導的信號轉導途徑有關。
　　方法：①通過G

2、enbank獲取選Tp0663、Tp0821和Tp0971的基因序列，以Tp Nichols株基因組DNA為模板，PCR擴增目的片段，將其亞克隆至原核表達載體 pET28a(+)中構建重組質粒 pET28a(+)/Tp0663、pET28a(+)/Tp0821和pET28a(+)/Tp0971，經PCR、雙酶切、測序鑒定后將其轉化至表達宿主菌E.coli Rosseta中，IPTG誘導表達。采用SDS-PAGE和Western blot

3、分析和鑒定表達產物；Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白，BCA法測定蛋白濃度；Detoxi-Gel?內毒素去除膠去除重組蛋白中的內毒素,經鱟試劑測定內毒素含量。②佛波酯（PMA）誘導人單核細胞THP-1轉化為巨噬細胞，用Tp0663、Tp0821和Tp0971重組蛋白刺激巨噬細胞，ELISA雙抗體夾心法檢測誘生其前炎癥細胞因子 IL-6和IL-1β的情況；用TLR2抗體、CD14抗體和PDTC預處理巨噬細胞后，用Tp0663、Tp082

4、1和p0971重組蛋白分別刺激巨噬細胞，ELISA分析TLR2抗體、CD14抗體和PDTC對重組蛋白誘導巨噬細胞產生IL-6和IL-1β的影響。
　　結果：構建的重組質粒經酶切和測序鑒定證實插入片段為目的基因，測序結果與Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE結果顯示，在IPTG誘導下，重組表達菌分別表達了一相對分子量（Mr）約為34kDa（Tp0663）和36 kDa（Tp0821），29 kDa（Tp0971）的重組

5、蛋白，目的蛋白在菌體細胞內以可溶性和包涵體形式存在，經Ni-NTA親和純化后，純度在95％以上，Western blot結果顯示其與目的蛋白大小相符；內毒素去除膠處理重組蛋白，經鱟試劑檢測內毒素小于0.04EU/mL；THP-1細胞經PMA刺激轉化為巨噬細胞，不同濃度的重組蛋白（0.5μg/ml～10μg/ml）能明顯誘導巨噬細胞產生IL-6和IL-1β；當重組蛋白濃度高于3μg/ml（Tp0663）和5μg/ml（Tp0821和Tp0

6、971）時，IL-6和IL-1β產生的量無明顯增加。TLR2抗體處理后，Tp0663, Tp0821和Tp0971誘導IL-6的產生量分別降至66.0%、64.0%和60.0%，IL-1β的產生量分別降至63.0%、62.0%和62.0%；經CD14抗體處理后, IL-6的產生量分別降至71.0%、73.0%和69.0%， IL-1β的產生量分別降至69.0%、70.0%和66.0%,經TLR2和CD14抗體聯(lián)合處理后 IL-6的產生量

7、分別降至54.0%、55.0%和56.0%，IL-1β的產生量分別降至51.0%、50.0%和52.0%，NF-κB特異性抑制劑PDTC處理后 IL-6和IL-1β的產生量分別降至20%以下，各處理組與對照組(同型抗體)比較(P<0.05)有明顯差異。
　　結論：
　　1. Tp0663、Tp0821和Tp0971重組蛋白能誘導巨噬細胞產生前炎癥 CKs IL-6和IL-1β；
　　2. Tp0663、Tp0821和T