HIV-1 Nef通過誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞高表達(dá)TLR2調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生.pdf

1、目的:HIV是一種能攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒,它把人體免疫系統(tǒng)中最重要的CD4+T淋巴細(xì)胞作為攻擊目標(biāo),以免疫系統(tǒng)功能耗竭、嚴(yán)重的免疫缺陷為結(jié)局,導(dǎo)致臨床上艾滋病的發(fā)生。艾滋病是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病,目前尚無有效的治療手段。本研究通過觀察 HIV-1的調(diào)節(jié)基因 Nef對淋巴細(xì)胞增殖和Treg細(xì)胞產(chǎn)生的影響,探討 HIV-1 Nef逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視功能可能存在的機(jī)制,為 HIV感染病人的治療提供新思路。
　　方法:(1)將質(zhì)粒

2、pcDNA3.1(+)-Nef和pcDNA3.1(+)(陰性對照)轉(zhuǎn)染 THP-1細(xì)胞,通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、western blot、細(xì)胞免疫熒光等方法檢測目的蛋白 HIV-1Nef在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位,利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測 THP-1-3.1和THP-1-Nef細(xì)胞表面 CD4分子的表達(dá),以此來評價(jià) Nef蛋白的生物學(xué)活性。(2)混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察 HIV-1 Nef對淋巴細(xì)胞增殖和Treg細(xì)

3、胞產(chǎn)生的影響。(3)通過 RT-PCR、FCM方法檢測 HIV-1 Nef對 THP-1細(xì)胞 TLR2表達(dá)的影響。采用共轉(zhuǎn)染法將 NF-κB熒光報(bào)告基因轉(zhuǎn)染 THP-1-Nef和THP-1-3.1細(xì)胞,通過測定熒光值(RLU)進(jìn)一步評價(jià) TLR2蛋白的表達(dá)變化。(4)利用RNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)并構(gòu)建靶向 TLR2基因的siRNA重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染 THP-1-Nef細(xì)胞,通過 RT-PCR、FCM檢測 siRNA序列對 TLR2基因表達(dá)的沉默效

4、果。通過測定 NF-κB活性來驗(yàn)證其對 TLR2基因的生物學(xué)活性影響。(5)再次混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)觀察 TLR2基因在 HIV-1 Nef對淋巴細(xì)胞增殖和Treg細(xì)胞產(chǎn)生的影響過程中扮演的重要角色。
　　結(jié)果:(1)建立穩(wěn)定細(xì)胞株:通過 G418對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選獲得穩(wěn)定表達(dá) Nef的THP-1細(xì)胞株和陰性細(xì)胞株 THP-1-3.1。RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-Nef質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞出現(xiàn)621bp條帶,對照組

5、 THP-1-3.1細(xì)胞無相應(yīng)條帶出現(xiàn);western blot結(jié)果見轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-Nef質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞約27KDa處檢測到目的條帶,表明pcDNA3.1(+)-Nef表達(dá)正確;熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-Nef質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞表達(dá)的Nef蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。通過 FCM檢測 CD4分子的表達(dá),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Nef質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞表面 CD4分子的表達(dá)顯著低于對照組 TH

6、P-1-3.1細(xì)胞。(2)混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn):THP-1-Nef細(xì)胞能抑制淋巴細(xì)胞的增殖,促進(jìn)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。(3) HIV-1 Nef誘導(dǎo) TLR2高表達(dá):RT-PCR分析顯示 THP-1-Nef細(xì)胞 TLR2 mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組細(xì)胞;流式圖顯示 THP-1-Nef細(xì)胞和THP-1-3.1細(xì)胞 TLR2陽性細(xì)胞百分率分別為61.2±6.5％,76.8±8.1％和10.5±1.425％, THP-1-Nef細(xì)胞的兩個(gè)

7、克隆相對對照組 THP-1-3.1細(xì)胞細(xì)胞膜表面 TLR2蛋白的表達(dá)有顯著差異(**,P<0.01)。(4)構(gòu)建靶向 TLR2基因的siRNA重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1-Nef細(xì)胞,經(jīng)過潮霉素篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。RT-PCR和FCM分析顯示構(gòu)建的兩個(gè)siRNA重組質(zhì)粒均可有效下調(diào) TLR2的表達(dá),同時(shí)下調(diào)了NF-κB的活性。(5)通過 siRNA干擾 TLR2表達(dá)之后,將獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株與人淋巴細(xì)胞 PBMC共培養(yǎng),流式結(jié)果顯示,

8、轉(zhuǎn)染了TLR2 siRNA重組質(zhì)粒的THP-1-Nef細(xì)胞相對于轉(zhuǎn)染了亂碼siRNA重組質(zhì)粒的THP-1-Nef細(xì)胞,其抑制PBMC增殖的功能有所回升,同時(shí)對 Treg細(xì)胞的增殖的影響也顯著減輕。
　　結(jié)論:本研究提示 HIV-1 Nef在誘導(dǎo) Treg細(xì)胞產(chǎn)生和抑制淋巴細(xì)胞增殖方面發(fā)揮了重要作用,可能與 HIV-1病毒逃避機(jī)體的免疫攻擊,降低機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) TLR2蛋白在 HIV-1 Nef誘導(dǎo) Treg