VEGF基因轉(zhuǎn)染后脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞的蛋白分泌及成骨活性的檢測(cè).pdf

1、目的：
　　從人脂肪組織中提取培養(yǎng)脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(Adipose Tissue DerivedStromal Cells，ADSCs)，了解其生物學(xué)特性；從人血管組織中分離提取血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，并與含綠色熒光蛋白的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體連接成重組質(zhì)粒pSELECT-GFPzeo-VEGF，將其分別轉(zhuǎn)染分離培養(yǎng)的不同代ADSCs，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的ADSCs對(duì)

2、VEGF mRNA的表達(dá)、VEGF蛋白水平的變化以及成骨活性。
　　方法：
　　膠原酶消化脂肪獲取細(xì)胞后，接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)傳代。通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定體外培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)志，觀察其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。選取第2代ADSCs分別于條件培養(yǎng)基進(jìn)行成脂、成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化，并分別采用油紅“O”、Von Kossa染色、堿性磷酸酶染色及甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色。另外，采用Trizol法提取人血管組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cD

3、NA，通過(guò)巢式PCR從cDNA中擴(kuò)增編碼VEGF成熟肽的基因序列，將獲得的目的基因VEGF與pGEM-T Easy線性載體進(jìn)行連接，再將連接成功的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，經(jīng)鑒定測(cè)序，進(jìn)行回收。然后對(duì)重組克隆載體pTA2-VEGF和含綠色熒光蛋白的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體pSELECT-GFPzeo-mcs進(jìn)行酶切處理和連接以獲得重組表質(zhì)粒pSELECT-GFPzeo-VEGF，經(jīng)再次鑒定測(cè)序，大量回收。最后經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組表質(zhì)粒p

4、SELECT-GFPzeo-VEGF分別轉(zhuǎn)染第2、3、4、5代ADSCs，并進(jìn)行免疫熒光鑒定，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染后分別于6h、12h、48h、72h回收轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組ADSCs上清液，采用ELISA對(duì)VEGF的分泌進(jìn)行定量檢測(cè)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另外，取第2代轉(zhuǎn)染后的ADSCs設(shè)為VEGF基因轉(zhuǎn)染組，另建兩對(duì)照組分別為空載體轉(zhuǎn)染組和空白細(xì)胞組，分別于成骨條件下進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)上清液中堿性磷酸酶、骨鈣

5、蛋白以及層粘連蛋白的分泌水平。
　　結(jié)果：
　　膠原酶消化結(jié)合密度梯度離心及差速貼壁培養(yǎng)法分離出的細(xì)胞表面標(biāo)記CD49d和CD44等呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，為具有干細(xì)胞特性的ADSCs。ADSCs于條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，經(jīng)染色證實(shí)具有成脂、成骨及成軟骨等多分化潛能。VEGF可以與含綠色熒光蛋白雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體成功構(gòu)建為重組質(zhì)粒pSELECT-GFPzeo-VEGF。熒光顯微鏡提示脂質(zhì)體介導(dǎo)的VEGF目的基因片段能夠成功轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的AD

6、SCs；經(jīng)ELISA定量檢測(cè)，上清液中VEGF mRNA表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染組顯著增高，空載體轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯變化，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P<0.05，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。成骨條件培養(yǎng)下，VEGF轉(zhuǎn)染后的ADSCs組對(duì)堿性磷酸酶、骨鈣蛋白及層粘連蛋白的分泌量明顯高于未轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　膠原酶消化結(jié)合密度梯度離心法及差速貼壁培養(yǎng)法可有效地從脂肪組織中獲得具有定向誘導(dǎo)分化能力的ADSCs。經(jīng)脂質(zhì)

7、體介導(dǎo)可成功將人VEGF目的基因片段轉(zhuǎn)染至人ADSCs，并能夠在體外持續(xù)有效的表達(dá)具有生物學(xué)活性的VEGFmRNA，分泌VEGF蛋白。在成骨條件培養(yǎng)下轉(zhuǎn)染后的ADSCs能夠大量分泌堿性磷酸酶、骨鈣蛋白以及層粘連蛋白，其成骨能力明顯增強(qiáng)。本試驗(yàn)可以將促血管治療和干細(xì)胞移植有效結(jié)合起來(lái)，轉(zhuǎn)染后的ADSCs可以有效促進(jìn)成骨及成血管化，并可以更好的粘附于支架材料，用以修飾構(gòu)建組織工程骨與軟骨進(jìn)行體內(nèi)修復(fù)，從而對(duì)骨折不愈合、延遲愈合或骨缺損等的治