免疫負(fù)調(diào)控因子TIPE2與核蛋白PCNP雙向調(diào)節(jié)在白血病細(xì)胞中的生物學(xué)作用.pdf

1、背景：白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病,由于白細(xì)胞在分化、成熟的過(guò)程中受到某些因素的影響使其分化發(fā)育停止,以至于白細(xì)胞停留在不同的發(fā)育階段并無(wú)限制地的克隆。在骨髓和其他造血器官中,白血病細(xì)胞大量堆積并抑制正常造血細(xì)胞的功能。白血病人的免疫系統(tǒng)的功能受到嚴(yán)重的抑制,以至于病人發(fā)生發(fā)熱、出血、貧血,后期累及體內(nèi)多種器官衰竭死亡。所以白血病人的免疫系統(tǒng)功能的恢復(fù)對(duì)白血病人的生存率和生活質(zhì)量都有很大的幫助。TNFAIP8L2(tumor n

2、ecrosis factor-a-induced protein-8 like2)即TIPE2是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要的免疫負(fù)調(diào)控因子,參與多種腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展。TIPE2在淋巴細(xì)胞白血病人的外周血中的表達(dá)量是升高的,TIPE2基因沉默后影響Jurkat細(xì)胞的生長(zhǎng),并影響JNK1和新型基因PCNP的表達(dá),由此,本課題主要研究的是TIPE2對(duì)白血病Jurkat細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響,以及TIPE2、PCNP、JNK1三者之間的關(guān)系,為更進(jìn)

3、一步探討TIPE2是否調(diào)控白血病的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。
　　目的：在白血病Jurkat細(xì)胞中將TIPE2基因過(guò)表達(dá)后,檢測(cè)其生物學(xué)功能的改變同時(shí)將PCNP和JNK1分別沉默和過(guò)表達(dá)后檢測(cè)對(duì)TIPE2的表達(dá)量的影響,和對(duì)Jurakt細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
　　方法：將TIPE2的CDS區(qū)重組到過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)中,并將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-TIPE2電轉(zhuǎn)到白血病Jurkat細(xì)胞中,加藥進(jìn)行篩選并篩出穩(wěn)定株。在

4、mRAN水平上用qPCR方法檢測(cè)TNFAIP8家族其他成員(TNFAIP8,TIPE1,TIPE3)的表達(dá)量。用臺(tái)盼藍(lán)染色人工計(jì)數(shù)的方法作出生長(zhǎng)曲線圖,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。用NBT檢測(cè)細(xì)胞的分化情況,用Transwell小室檢驗(yàn)對(duì)細(xì)胞遷移的影響。用免疫印跡雜交(Western Blot)方法檢測(cè)TIPE2過(guò)表達(dá)后對(duì)基因PCNP(PEST-containing nuclear protein))、JNK1(c-Jun N-

5、terminal kinase1,JNK1)、Caspase3、Caspase8的表達(dá)量的影響,從而分析TIPE2在白血病中可能發(fā)揮的作用。在Jurkat細(xì)胞中利用基因沉默技術(shù)將PCNP沉默和利用基因抑制劑將JNK1基因沉默后觀察對(duì)TIPE2的影響,另一方面將PCNP和JNK1過(guò)表達(dá)后觀察對(duì)TIPE2的影響,同時(shí)檢測(cè)PCNP和JNK1對(duì)Jurkat細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,進(jìn)而弄清楚TIPE2、PCNP、JNK1三者之間的關(guān)系以及是怎樣影響

6、Jurkat細(xì)胞生物學(xué)功能的。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建TIPE2基因過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到Jurkat細(xì)胞中,在mRNA水平, qPCR結(jié)果顯示TIPE2基因過(guò)表達(dá)比對(duì)照組高30多倍(P<0.05),在蛋白水平,Western Blotting結(jié)果顯示TIPE2基因過(guò)表達(dá)后的表達(dá)量也是增高的。qPCR結(jié)果顯示,TIPE2基因過(guò)表達(dá)后使TIPE3的表達(dá)量上調(diào)(P<0.05),而對(duì)TNFAIP8和TIPE1沒有太大的影響(P>0.05

7、)。臺(tái)盼藍(lán)染色人工計(jì)數(shù)結(jié)果顯示TIPE2基因過(guò)表達(dá)后Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)增快(P<0.05)。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯變化(P>0.05),細(xì)胞凋亡也沒明顯變化(P>0.05),Western Blot結(jié)果顯示并沒有激活Caspase3和Caspase8,所以這兩方面說(shuō)明TIPE2不影響細(xì)胞的凋亡。利用NBT方法檢測(cè)細(xì)胞的分化情況,結(jié)果沒有明顯的差異(P>0.05)。利用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移的情況,發(fā)現(xiàn)TIPE2

8、過(guò)表達(dá)后細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)了(P<0.05)。Western Blott結(jié)果顯示,TIPE2過(guò)表達(dá)后PCNP的表達(dá)量降低(P<0.05)而JNK1的表達(dá)量增加(P<0.05)。將PCNP和JNK1分別沉默和過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn),PCNP通過(guò)影響細(xì)胞周期來(lái)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.05),但對(duì)細(xì)胞凋亡沒有影響(P>0.05),對(duì)細(xì)胞分化沒有明顯的影響(P>0.05),對(duì)細(xì)胞的遷移沒有明顯影響(P>0.05)。而JNK1對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、分化和遷移

9、都沒有明顯的影響(P>0.05)。Western Blot結(jié)果顯示PCNP對(duì)TIPE2有影響而對(duì)JNK1沒有影響,而JNK1對(duì)TIPE2沒有影響對(duì)PCNP有影響。這就說(shuō)明三者之間相互作用從而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。
　　結(jié)論：
　　1.TIPE2可以通過(guò)影響PCNP和JNK1來(lái)影響Jurkat細(xì)胞的生長(zhǎng),但對(duì)細(xì)胞凋亡沒有影響。TIPE2可以影響Jurkat細(xì)胞的遷移,并與之呈正比;
　　2.PCNP可以通過(guò)影響細(xì)胞周期來(lái)