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文檔簡介
1、目的:在細(xì)胞水平,研究口腔癌瘤苗TCV-4-1BBL 聯(lián)合CD28 單克隆抗體(CD28 mAb)誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞抗腫瘤活性的能力。
方法:1.建立穩(wěn)定表達(dá)4-1BBL克隆細(xì)胞株:通過脂質(zhì)體法將真核載體pEGFP-4-1BBL轉(zhuǎn)染人口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113,經(jīng)G418(400μg/ml)篩選及有限稀釋后獲得穩(wěn)定高表達(dá)4-1BBL克隆細(xì)胞株Tca8113-4-1BBL,分別用RT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)
2、胞中4-1BBL mRNA和蛋白的表達(dá)。2.制備瘤苗:將轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染4-1BBL基因的Tca8113細(xì)胞用絲裂霉素C(MMC)處理后,制成腫瘤細(xì)胞瘤苗,分別命名TCV-4-1BBL、TCV-Tca8113。3. TCV-4-1BBL瘤苗聯(lián)合CD28mAb誘導(dǎo)抗腫瘤活性的能力: TCV-4-1BBL聯(lián)合CD28 mAb與經(jīng)體外CD3單克隆抗體(CD3mAb)誘導(dǎo)的人外周血T淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)分四組,①Tca8113組:T淋巴細(xì)胞+TC
3、VTca8113;②Tca8113+CD3 mAb組: T淋巴細(xì)胞+CD3 mAb+TCV-Tca8113; ③Tca8113-4-1BBL+CD3 mAb組:T淋巴細(xì)胞+CD3 mAb+TCV- 4-1BBL; ④Tca8113-4-1BBL+CD3 mAb組+CD28 mAb:T淋巴細(xì)胞+CD3 mAb+TCV- 4-1BBL+CD28 mAb。各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)72小時(shí)后,臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)T細(xì)胞、用Cell Counting Kit-8(
4、CCK-8)測細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)殺傷活性,ELISA法檢測細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ的分泌。
結(jié)果;1. 熒光顯微鏡下觀測到轉(zhuǎn)染了pEGFP-4-1BBL的Tca8113 細(xì)胞(Tca8113 -4-1BBL)綠色熒光蛋白的表達(dá),RT-PCR、western blot 在mRNA和蛋白水平檢測到4-1BBL 表達(dá)。2.72h后臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)上述混合培養(yǎng)的T 細(xì)胞,④組1.78±0.16,高于①組0.917±0.12
5、,②組1.01±0.14 及③組1.38±0.15,P<0.05,促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖。3. 72h后測CTL的殺傷活性:④組59.2±5.1,高于②組25.7±3.5 及③組38.9± 3.4,P<0.05,促進(jìn)T 細(xì)胞的活化。4. 72h后各組IL-2的分泌:④組881.2131±78,顯著高于①組56.1619 ±13,②組176.4235±33,③組526.1235±67,P<0.05,促進(jìn)IL-2分泌。5. 72h后各組IFN-
6、γ的分泌:④組402.81±34高于其他各組(②組(69.83±13),③組246.87±24,①組37.85±11),促進(jìn)IFN-γ的分泌。
結(jié)論:pEGFP/neo-4-1BBL 真核表達(dá)載體在Tca8113細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá),口腔癌瘤苗Tca8113-4-1BBL構(gòu)建成功。在細(xì)胞水平顯示,TCV- 4-1BBL瘤苗聯(lián)合CD28 mAb,能增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤免疫功能,促進(jìn)T細(xì)胞增殖、活化,促進(jìn)IL-2、IFN-γ分泌可能
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