重組人IL-24腺病毒表達載體的構建及對喉腫瘤細胞的生物學效應.pdf

1、背景與目的：喉癌是耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤,約90％以上是鱗狀細胞癌。喉癌的發(fā)病率在近幾年有上升的趨勢,這與診斷水平的提高、生活習慣改變以及空氣污染都有關系。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示:喉癌的發(fā)病率在城市高于農(nóng)村,在重工業(yè)發(fā)達的城市高于輕工業(yè)發(fā)達城市。手術治療是喉癌最常用的治療手段,隨著頭頸外科的發(fā)展,喉外科手術不斷完善,患者的5年生存率及生存質(zhì)量明顯提高。但仍有30％-40％的患者,在經(jīng)過根治手術和放化療治療后復發(fā)或轉移。當出現(xiàn)復發(fā)和/或遠處轉移時

2、患者對放化療多不敏感,3年生存率僅為10％。因此如何進一步提高喉癌的療效成為當務之急。隨著分子生物學和基因工程的飛速發(fā)展,基因免疫治療日益受到重視,顯示出良好的發(fā)展前景。
　　 白細胞介素24,又名黑色素瘤分化相關抗原7(melanoma differentiation associatedantigen7,MDA-7),它主要由CD3+T淋巴細胞和單核細胞表達,為分泌型蛋白,屬于IL-10家族成員。研究顯示IL-24是目前發(fā)現(xiàn)

3、唯一一種既具有抑制腫瘤細胞生長和血管形成又具有免疫刺激作用的細胞因子。這種抑制作用并不依賴p53、Rb和p16等抑癌基因,對正常細胞幾乎無影響?，F(xiàn)已成為腫瘤治療研究熱點。
　　 mda-7/IL-24對多種腫瘤細胞有抑制作用,但尚不清楚它對喉癌細胞是否具有相似的作用。為此我們對其進行了克隆,通過腺病毒介導進行體外過量表達,觀察對喉癌細胞Hep2增殖的影響并對作用機制進行初步探討。具體工作如下:
　　 方法:
　　

4、 1.利用PHA刺激培養(yǎng)人外周血淋巴細胞使其表達IL-24基因,采用RT-PCR方法得到mda-7/IL-24編碼的cDNA。構建T克隆載體Peasy-T1 Simpie-IL-24。
　　 2.從T克隆載體Peasy-T1 Simple-IL-24中大量擴增mda-7/IL-24,酶切回收目的片段插入到pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒中,與pAdEasy骨架質(zhì)粒在E.coli BJ5183中進行同源重組為腺病毒載體質(zhì)粒,線形化

5、后轉染293A細胞進行包裝。TCID50方法測得病毒效價、PCR和Western-blot鑒定重組腺病毒Ad-mda-7/IL-24。
　　 3.Ad-mda-7/IL-24感染喉癌細胞及相關生物學檢測:Ad-mda-7/IL-24和Adv分別感染人喉癌細胞Hep2,MTT觀察Ad-mda-7/IL-24對人喉癌細胞Hep2的增殖影響,RT-PCR法檢測感染后相關基因mRNA表達情況,Western-blot檢測感染后相關蛋白表

6、達。
　　 結果:
　　 1.通過RT-PCR從PHA刺激培養(yǎng)的人外周血淋巴細胞中克隆出mda-7/IL-24編碼cDNA。構建T克隆載體Peasy-T1 Simple-IL-24成功。經(jīng)酶切和測序驗證為正確的IL-24 cDNA。
　　 2.經(jīng)基因重組技術獲得腺病毒表達相關的一系列載體,穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV-mda-7/IL-24、含目的基因的腺病毒質(zhì)粒pAd-mda-7/IL-24和空載體腺病毒質(zhì)粒

7、pAd,經(jīng)酶切和測序驗證正確。成功構建了腺病毒表達系列載體。質(zhì)粒線性化后經(jīng)脂質(zhì)體法轉染293A細胞后,能夠在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光,RT-PCR檢測出IL-24 mRNA的表達,Western Blot鑒定有目的蛋白IL-24的表達。
　　 3.Ad-mda-7/IL-24感染Hep2細胞后對Hep2細胞的增殖活性有較強抑制作用:凋亡相關分子Fas、BAX、Caspase-3表達有明顯增強,BCL-2表達則下降。
　　

8、 結論:
　　 腫瘤治療的主要目的就是抑制腫瘤的生長和改善患者的預后,基礎研究的首要任務則為闡明腫瘤的發(fā)生機制以及腫瘤治療基因的功能機制。本研究通過克隆腫瘤抑制基因mda-7/IL-24,并構建重組腺病毒載體包裝含目的基因的腺病毒以揭示其過表達對喉癌細胞的作用,并對其作用機制進行初步探討。結果顯示,成功構建了含目的基因IL-24的腺病毒表達載體,并且病毒包裝成功。證明IL-24對喉癌細胞Hep2的增殖有較明顯的抑制作用,這種抑制