脂肪干細(xì)胞向骨、軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及新型椎間盤支架構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 1.探討兔脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)向骨、軟骨細(xì)胞定向分化的能力，為構(gòu)建組織工程骨軟骨提供理想的種子細(xì)胞;比較軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)法和誘導(dǎo)液培養(yǎng)法誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化的效果，為構(gòu)建組織工程骨軟骨提供更加有效的誘導(dǎo)方法。
　　 2.用脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)(cell-free deminerized bone matrix，CFDBM)和脫細(xì)胞髓核基質(zhì)構(gòu)建新型一

2、體化纖維環(huán)-髓核雙相支架，并進(jìn)行理化檢測(cè)，探討其作為組織工程椎間盤支架的可行性;探討不同脫細(xì)胞方法對(duì)豬尾椎間盤纖維環(huán)組織結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)特性的影響，為構(gòu)建組織工程纖維環(huán)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.分離、培養(yǎng)兔ADSCs，將第3代ADSCs分別用成骨誘導(dǎo)液及軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，14天后通過組織學(xué)觀察和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其分別向骨、軟骨細(xì)胞定向分化的能力。
　　 2.分別用與軟骨細(xì)胞

3、共培養(yǎng)法和誘導(dǎo)液培養(yǎng)法誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化并鑒定，顯微鏡觀察ADSCs的形態(tài)變化，14天后行甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定軟骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)情況，比較兩種方法的誘導(dǎo)效果。
　　 3.取豬股骨近端松質(zhì)骨，塑形成外徑10 mm、內(nèi)徑5mm、厚3mm的骨環(huán)，經(jīng)脫脂、脫鈣、脫細(xì)胞處理制備成纖維環(huán)相支架部分;取豬尾髓核組織，脫細(xì)胞后粉碎離心，制備脫細(xì)胞髓核基質(zhì)，注入纖維環(huán)相支架中央，冷凍干燥，交聯(lián)，作為

4、髓核相支架部分。通過大體觀察、HE染色、掃描電鏡觀察纖維環(huán)-髓核雙相支架的結(jié)構(gòu);測(cè)定支架的孔隙率、吸水率、壓縮彈性模量;MTT法檢測(cè)支架浸提液對(duì)ADSCs增殖的影響;Live/Dead染色觀察細(xì)胞在支架上的活性。
　　 4.取新鮮豬尾纖維環(huán)，分別用三種脫細(xì)胞方法（分別含有Triton X-100、SDS、胰蛋白酶）對(duì)其進(jìn)行脫細(xì)胞處理。大體觀察脫細(xì)胞處理后的纖維環(huán)，采用組織學(xué)與掃描電鏡觀察脫細(xì)胞情況及超微結(jié)構(gòu)的變化;測(cè)定脫細(xì)胞纖維

5、環(huán)的膠原含量、GAG含量及力學(xué)參數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 1.ADSCs體外培養(yǎng)呈長(zhǎng)梭形，增殖迅速，穩(wěn)定性好。經(jīng)過誘導(dǎo)逐漸變?yōu)槌晒羌败浌菢蛹?xì)胞，14天后成骨誘導(dǎo)的ADSCs堿性磷酸酶染色、茜素紅染色和von Kossa染色均為陽性;成軟骨誘導(dǎo)的ADSCs甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組化陽性，Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、SOX9的基因轉(zhuǎn)錄水平明顯增高。
　　 2.兩種方法培養(yǎng)的ADSCs逐漸變?yōu)檐浌菢蛹?xì)胞，甲苯胺藍(lán)、Ⅱ型膠原

6、免疫組化均為陽性，其中誘導(dǎo)液培養(yǎng)法細(xì)胞染色更深，且Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、SOX9的基因轉(zhuǎn)錄水平明顯高于軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)法。
　　 3.大體觀察支架呈乳白色;HE染色顯示無細(xì)胞殘留;掃描電鏡可見外層纖維環(huán)相支架孔徑大小均勻一致，孔隙相互貫通，中央脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲連接成網(wǎng)，交界處結(jié)合緊密。纖維環(huán)相支架孔徑為(343.00±88.25)μm，一體化支架孔隙率為82.98％±7.02％、吸水率為621.53％±53.31％，壓縮彈性模量為

7、(89.07±8.73) kPa。經(jīng)MTT測(cè)定支架浸提液對(duì)細(xì)胞的增殖無影響;Live/Dead染色可見細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)良好。
　　 4.組織學(xué)及掃描電鏡可見Triton X-100、SDS、胰蛋白酶三組均無細(xì)胞殘留;Triton X-100組纖維環(huán)超微結(jié)構(gòu)未見破壞，胰蛋白酶組輕度破壞，SDS組明顯破壞。三組纖維環(huán)膠原含量與天然纖維環(huán)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;但GAG含量均低于天然纖維環(huán)(P＜0.05)。Triton X-100、胰蛋白酶

8、兩組的力學(xué)性能與天然纖維環(huán)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，SDS組力學(xué)參數(shù)均低于天然纖維環(huán)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在特定條件下ADSCs可以向成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞定向分化;軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)法和誘導(dǎo)液培養(yǎng)法均可誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞定向分化，誘導(dǎo)液培養(yǎng)法誘導(dǎo)效果更好。
　　 2.用CFDBM和脫細(xì)胞髓核基質(zhì)制備的一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架具有合適的孔徑和孔隙率，無毒，力學(xué)性能與天然椎間盤接近，是構(gòu)建組織工程椎間