mCLCA3在小鼠氣道粘液高分泌及氣道炎癥中作用的研究.pdf

1、研究背景
　　支氣管哮喘是一種復(fù)雜的可遺傳的氣道慢性炎癥性疾病,出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的喘息,胸悶,氣急,咳嗽,哮鳴音等非特異性癥狀及體征,常伴有可逆性氣道阻塞及氣道高反應(yīng)性[1],而這種特征性的可逆性氣道阻塞及氣道高反應(yīng)性被認(rèn)為是由支氣管粘膜慢性炎癥所引起的[2,3],這些炎癥以不同程度氣道上皮粘液高分泌,杯狀細(xì)胞化生及纖維化為特征[4]。因此氣道上皮在氣道防御機(jī)制中起重要作用,有證據(jù)表明氣道上皮功能紊亂是慢性哮喘病人的根本所在[5]。<

2、br>　　CLCA是鈣激活性氯離子通道蛋白家族,mCLCA3(別名gob-5)是其成員之一[6,7],目前已有15種CLCA成員在6種哺乳動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)。其中四種為人源hCLCA1、hCLCA2、hCLCA3及hCLCA4(別名為hCaCC2),六種為鼠源mCLCA1、mCLCA2、mCLCA3(別名為gob-5)、mCLCA4、mCLCA5及mCLCA6,兩種為牛源性成員bCLCA1(別名為CaCC)及bCLCA2(別名為Lu-ECAM

3、-1),一種豬源性成員pCLCA1,一種馬源性成員eCLCA1,以及一種大鼠同源性成員[8,9]。CLCA基因表達(dá)與氣道疾病之間的聯(lián)系非常有趣,因?yàn)檫@些疾病都與氣道粘液過度分泌有關(guān),并且CLCA家族中至少一個(gè)成員是選擇性表達(dá)于粘液細(xì)胞的[10-12]。在最早的研究中,人們用CLCA蛋白基因轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞引起鈣激活性氯離子電流,發(fā)現(xiàn)了它的類蛋白通道功能,并將其視為通道蛋白,但后經(jīng)證實(shí)CLCA蛋白是可溶性的分泌分子[8,13],是否具

4、有鈣激活性氯離子通道功能卻尚未被證實(shí)。這些家族成員具有相似的特征,蛋白結(jié)構(gòu)分析表明大多數(shù)CLCA成員初級(jí)翻譯產(chǎn)物蛋白分子量一致,均為大小為100KD含有氨基末端信號(hào)肽的蛋白質(zhì),這一初級(jí)蛋白糖基化形成大小為130KD的糖蛋白,然后斷裂成兩個(gè)大小分別為90KD和40KD的亞基。另有研究表明在距離C-端240個(gè)氨基酸處有一個(gè)水解酶位點(diǎn)[14],120KD的糖蛋白被水解為N-端85KD及C-端35KD,兩個(gè)片段均含有多個(gè)N-linked糖基化位

5、點(diǎn)。CLCA蛋白結(jié)構(gòu)的相似性是其功能及表達(dá)部位具有高度同源性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　mCLCA3最早發(fā)現(xiàn)并克隆自小鼠腸道組織,mCLCA3及其人類同源的hCLCA1蛋白已經(jīng)被鑒定為是與分泌腺功能紊亂性疾病具有臨床相關(guān)性的分子,包括哮喘及囊性纖維化等。它存在于胃腸道、呼吸系統(tǒng)及子宮杯狀細(xì)胞,大量表達(dá)于正常小鼠的胃、小腸、結(jié)腸及子宮,僅少量表達(dá)于氣道組織[15];有研究表明mCLCA3在哮喘小鼠肺組織中呈現(xiàn)高表達(dá),我們前期的研究也證實(shí)了這一

6、點(diǎn),并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與過敏原的刺激呈現(xiàn)時(shí)間依賴性[16,17]。mCLCA3在正常小鼠肺組織幾乎無表達(dá),說明mCLCA3并不參與正常小鼠肺生理,其表達(dá)與哮喘性疾病具有緊密相關(guān)性。AtsushiNakanishi的研究中,經(jīng)過敏原刺激后,小鼠胃、小腸及結(jié)腸中mCLCA3的表達(dá)量與正常小鼠處于同一水平,但在肺組織中卻有顯著增高,說明mCLCA3選擇性表達(dá)于致敏小鼠的氣道杯狀細(xì)胞[18]。該實(shí)驗(yàn)還將mCLCA3高表達(dá)及低表達(dá)質(zhì)粒包裝成腺病毒,

7、通過氣管內(nèi)給藥的方式轉(zhuǎn)染致敏小鼠,結(jié)果氣道粘液表達(dá)相應(yīng)增高及降低,表明mCLCA3是氣道粘液表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。mCLCA3高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染粘液腺樣細(xì)胞NCI-292,致粘液蛋白Muc5ac表達(dá)量增高[18,19],進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論,即mCLCA3高表達(dá)不論在體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)均與粘液高分泌及杯狀細(xì)胞化生有關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在探討小鼠模型中,mCLCA3在氣道粘液高分泌、氣道炎癥及趨化因子合成中的地位。為此我們將mCLCA3高表達(dá)

8、質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑通過滴鼻的方式轉(zhuǎn)染正常小鼠,觀察氣道炎癥的變化,檢測(cè)Muc5ac、炎性介質(zhì)CCL2、CCL5、CCL11及細(xì)胞因子IL13、IL-4、IL-5、IFN-γ的表達(dá)水平。明確mCLCA3與粘液蛋白Muc5ac、趨化因子及Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)之間的關(guān)系,以助進(jìn)一步研究mCLCA3上調(diào)粘液表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,為治療哮喘提供新的思路。
　　目的:研究哮喘相關(guān)基因mCLCA3對(duì)粘液蛋白Muc5ac、趨化因子及Th1/Th2

9、細(xì)胞因子表達(dá)的影響及其在小鼠氣道炎癥中的作用。
　　方法:實(shí)驗(yàn)共分為三組:①正常小鼠+陰性對(duì)照質(zhì)粒組,②正常小鼠+mCLCA3高表達(dá)質(zhì)粒組,③哮喘小鼠。通過滴鼻的方式將轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒配制成的轉(zhuǎn)染緩沖液滴入各組小鼠鼻腔內(nèi),隨呼吸進(jìn)入氣道。用Real-timePCR的方法檢測(cè)各組小鼠肺組織內(nèi)mCLCA3、Muc5ac,趨化因子CCL2、CCL5、CCL11及細(xì)胞因子IL13、IL-4、IL-5、IFN-γ在mRNA水平的表達(dá)變化。用W

10、estern-blotting和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)mCLCA3在蛋白水平的表達(dá)量及表達(dá)部位。對(duì)各組小鼠肺泡灌洗液中總炎性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),觀察肺組織炎癥變化;小鼠肺組織行HE染色對(duì)氣道進(jìn)行炎癥分?jǐn)?shù)評(píng)分了解氣道炎癥情況。
　　結(jié)果:免疫組織化學(xué)表明mCLCA3僅表達(dá)于小鼠氣道上皮細(xì)胞。Real-timePCR表明mCLCA3mRNA在哮喘組及正常+高表達(dá)質(zhì)粒組均明顯高于正常對(duì)照組,P<0.05;而哮喘組與正常+高表達(dá)質(zhì)粒組相比較,P>

11、0.05,mRNA水平的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。mCLCA3Western-blotting結(jié)果表明:①mCLCA3在蛋白水平的變化趨勢(shì)與mRNA水平相同;②條帶分布:正常對(duì)照組小鼠肺組織幾乎無mCLCA3蛋白表達(dá),哮喘組及正常+高表達(dá)質(zhì)粒組在75KD、90～100KD及125～130KD均有顯著表達(dá);③選取90～100KD條帶做灰度分析:哮喘組及正常+高表達(dá)質(zhì)粒組均較正常對(duì)照組顯著升高,P﹤0.05;正常+高表達(dá)質(zhì)粒組與哮喘組相比較,P<0

12、.05,表明正常+高表達(dá)質(zhì)粒組在蛋白水平的表達(dá)量較哮喘組低。Muc5ac和IL-13的Real-timePCR結(jié)果表明:哮喘組及正常+高表達(dá)質(zhì)粒組均較正常對(duì)照組明顯升高,P<0.05;哮喘組與正常+高表達(dá)質(zhì)粒組相比較,P>0.05,二者表達(dá)量無顯著差異。趨化因子CCL-2、CCL-5、CCL-11及Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5的Real-timePCR結(jié)果均表明,哮喘組較正常對(duì)照組明顯升高,P<0.05;正常+高表達(dá)質(zhì)粒組較正常對(duì)照

13、組有升高,但P>0.05,未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)準(zhǔn);Th1細(xì)胞因子IFN-γ的mRNA表達(dá)量在哮喘組或正常+高表達(dá)質(zhì)粒組均無顯著升高。相關(guān)性分析表明:肺組織中mCLCA3mRNA與粘液蛋白Muc5acmRNA(r=0.759,P=0.000)及IL13mRNA(r=0.776,P=0.000)的表達(dá)成總體正相關(guān),在0.01水平上具有顯著相關(guān)性;IL13mRNA與Muc5acmRNA成總體正相關(guān)(r=0.895,P=0.000),在0.01水平