乙醇對(duì)人肝L02細(xì)胞糖原和GSK-3β、P-AMPK的影響.pdf

1、背景： 飲酒過(guò)量已成為嚴(yán)重社會(huì)問(wèn)題，乙醇是現(xiàn)代社會(huì)濫用最廣的成癮物質(zhì)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，過(guò)量攝入乙醇可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生多方面不利影響，如酒精性肝炎、脂肪肝等，并可影響糖、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的體內(nèi)代謝。正常血糖水平對(duì)維持機(jī)體能量代謝有著重要作用，而乙醇攝入對(duì)糖代謝的影響已引起廣泛關(guān)注。資料顯示，急性乙醇中毒可導(dǎo)致嚴(yán)重低血糖，但在一定條件下，乙醇又可導(dǎo)致高血糖，并認(rèn)為這主要取決于體內(nèi)糖原儲(chǔ)備是否充足。研究乙醇對(duì)糖原代謝的影響具有重要意義。

2、 糖原合成與分解是肝臟生化功能的重要方面，它不僅為自身的生理活動(dòng)提供能量，也為其他器官的能量需要提供葡萄糖，血糖水平下降引起機(jī)體儲(chǔ)備的糖原分解和糖異生作用增強(qiáng)。糖原合酶（glycogen synthase，GS）是糖原合成過(guò)程的關(guān)鍵酶，其活性受到磷酸化形式的調(diào)節(jié)。糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）則可在體內(nèi)磷酸化糖原合酶，使其失活，負(fù)調(diào)控糖原合成。GSK-3為絲/蘇氨酸蛋白激酶

3、，有兩個(gè)同功異構(gòu)體，分別是GSK-3α、GSK-3β。GSK-3本身亦可被磷酸化（GSK-3α的Ser21或GSK-3β的Ser9）而失活，使得糖原合酶的磷酸化受到抑制，從而促進(jìn)糖原合成。測(cè)定GSK-3的水平，能反映出活性GS的表達(dá)狀況。目前研究較多集中于GSK-3β。有研究認(rèn)為，乙醇攝入后可減少大鼠肝臟糖原含量，降低大鼠肝臟糖原合酶的活性及表達(dá)，但并未報(bào)道對(duì)GSK-3β的影響，亦未見(jiàn)關(guān)于乙醇對(duì)人類(lèi)肝細(xì)胞GSK-3β影響的報(bào)道。

4、 腺苷酸激活的蛋白激酶（AMP—activated protein kinase，AMPK）為外周組織細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，近年來(lái)被認(rèn)為與糖代謝過(guò)程關(guān)系密切，它有α、β、γ三個(gè)亞單位，細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值升高可激活A(yù)MPK，其中α亞單位Thr172的磷酸化（P-AMPK）對(duì)AMPK激活，發(fā)揮其激酶活性至關(guān)重要。每克乙醇本身可提供熱量7.1kcal/g，干擾機(jī)體能量代謝。目前有研究報(bào)道，乙醇作用后，小鼠的AMPK活性可增強(qiáng)或降低，而對(duì)于

5、乙醇對(duì)人類(lèi)肝細(xì)胞反應(yīng)能量代謝的AMPK的影響以及AMPK對(duì)GSK—3的變化又有何影響目前仍是未知領(lǐng)域。 乙醇對(duì)糖原代謝過(guò)程的研究較少，而對(duì)人類(lèi)肝細(xì)胞糖原代謝的影響更是罕見(jiàn)報(bào)道。本研究選取正常人類(lèi)肝L02細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察乙醇直接作用后，人肝L02細(xì)胞內(nèi)糖原含量變化，并進(jìn)一步研究乙醇對(duì)糖原合成代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶GSK—3β的影響、P—AMPK的表達(dá)變化，初步探討P—AMPK對(duì)GSK—3β的影響。 目的： 1、研

6、究乙醇對(duì)體外培養(yǎng)的人肝L02細(xì)胞糖原含量及GSK-3β、P-AMPK的影響。 2、通過(guò)加入AMPK的激動(dòng)劑（5—Aminoimidazole—4—carboxamide—1—b—D—ribofur—anoside，AICAR）與阻斷劑（6—[4—（2—piperidin—1—yl—ethoxy）—phenyl]—3—pyridin—4—yl—pyyrazolo[1，5—a] pyrimidine，Compound C），間接觀察

7、P—AMPK對(duì)GSK—3β的影響。 方法： 人肝L02細(xì)胞于37℃、5% CO2條件下在改良RPMI1640中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，每2—3 d換液。在處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞中加入乙醇，并按加入乙醇濃度的不同分為0 mmol/L組、50 mmol/L組、100 mmol/L組，0mmol/L組細(xì)胞正常換液，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞；采用蒽酮—硫酸比色法測(cè)定細(xì)胞糖原濃度，同時(shí)提取細(xì)胞DNA并測(cè)定濃度；蛋白免疫印跡法（

8、Western Blot）檢測(cè)GSK-3β及P-AMPK表達(dá)水平；并用AICAR（0.5 mmol/L）和Compound C（10μmol/L）預(yù)處理0mmol/L組和100 mmol/L組細(xì)胞1h，再與乙醇共同作用24 h，檢測(cè)GSK—3β蛋白表達(dá)。結(jié)果采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1、50 mmol/L組和100 mmol/L組分別與0mmol/L組相比較： （1）L02細(xì)胞內(nèi)糖原含量分別下降

9、41.3%（P<0.01）和52.8%（P<0.01）； （2）GSK-3β表達(dá)相對(duì)水平分別增加15.2%（P=0.011）和20.1%（P=0.002）； （3）P-AMPK表達(dá)相對(duì)水平分別增加8.99%（P=0.002）和10.3%（P=0.001）； （4）50 mmol/L和100 mmol/L兩組比較，糖原含量、GSK-3β及P-AMPK表達(dá)相對(duì)水平均未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、加入AICAR和C

10、ompound C后，0mmol/L組和100 mmol/L組GSK-3β表達(dá)均未見(jiàn)明顯變化，兩組間未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、乙醇作用后明顯降低體外培養(yǎng)的人肝L02細(xì)胞內(nèi)糖原含量，可能干擾其糖原合成。 2、乙醇作用后人肝L02細(xì)胞內(nèi)GSK-3β表達(dá)增加，推測(cè)其與糖原含量下降有關(guān)。 3、乙醇作用后P-AMPK表達(dá)增加，推測(cè)乙醇干擾了L02細(xì)胞的能量變化，導(dǎo)致P-AMPK的變化，并且AMPK的變化可能