非洲豬瘟病毒實驗室診斷技術(shù)研究及試劑儲備.pdf

1、非洲豬瘟(Afican swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的豬的一種急性、高度致死性傳染病。1921年，ASF最初發(fā)現(xiàn)于肯尼亞，上世紀(jì)五、六十年代在非洲、歐洲、南美洲流行。近幾年來ASF流行范圍有擴大趨勢，已傳播到格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆、俄羅斯聯(lián)邦等我國周邊國家，使我國養(yǎng)豬業(yè)面臨嚴(yán)重威脅。由于ASFV感染機制復(fù)雜，目前沒有疫苗用于防疫，因此快速、準(zhǔn)確

2、的診斷是控制該病傳播和發(fā)生的關(guān)鍵。我國為ASF非疫區(qū)國家，國際參考實驗室的一些診斷方法及試劑不僅來源有限、價格昂貴，而且不完全適合國內(nèi)使用，因此開展相關(guān)ASF診斷技術(shù)研究并儲備一定診斷試劑顯得尤為必要。為此，本研究建立了ASFV核酸擴增納米金檢測、抗體檢測間接ELISA以及膠體金快速檢測試紙條，這對我國ASF防控具有重要意義。
　　1.ASFV核酸納米金擴增方法的建立
　　根據(jù)22株ASFV p72基因序列比對分析結(jié)果，選擇

3、高保守區(qū)域序列設(shè)計PCR引物和核酸雜交探針，將烷巰基修飾的探針標(biāo)記上納米金顆粒，制備納米金檢測探針，并與生物素標(biāo)記的捕捉探針一起加入PCR擴增的p72基因保守序列（大小651bp）進(jìn)行雜交，雜交產(chǎn)物加入親和素包被的反應(yīng)板，用銀染法進(jìn)行信號放大，對反應(yīng)條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，檢測結(jié)果表明:雜交陽性產(chǎn)物在反應(yīng)板中形成肉眼可見的黑色沉淀，檢測目標(biāo)序列的靈敏度達(dá)到10fmol/L。為了進(jìn)一步提高反應(yīng)的特異性，對100株不同基因型ASFV p72基因序

4、列進(jìn)行比對分析，選擇p72基因高度保守（同源性為98％-100％）的1492-1908堿基區(qū)域為靶序列，設(shè)計通用PCR引物、捕捉探針和檢測探針各兩對，并將不同引物和探針進(jìn)行組合，檢測結(jié)果顯示:雙重PCR及探針組合的檢測靈敏度可達(dá)到1fmol/L。用建立的通用PCR引物、生物素標(biāo)記的探針以及納米金標(biāo)記探針檢測11株ASFV p72基因，同時設(shè)立豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬2型圓環(huán)病毒(PCV-2)、豬瘟病毒(CSFV

5、)以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)對照，檢測結(jié)果顯示:不同基因型的11株ASFV核酸均為檢測陽性，而PRV、PPV、PCV-2、CSFV和PRRSV核酸均為檢測陰性，表明建立的ASFV核酸納米金擴增法具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。
　　為了進(jìn)一步驗證核酸納米金擴增法檢測組織細(xì)胞中ASFV的效果，以PRV Bartha K61基因組為模板，PCR擴增的TK基因同源臂以及GFP報告基因和ASFV p72基因表達(dá)盒，構(gòu)建重組BA

6、C轉(zhuǎn)移載體，與PRV Bartha K61株基因組共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，經(jīng)過多輪挑選熒光斑，獲得了重組病毒rPRV-p72resc;以104TCID50劑量的重組病毒滴鼻感染ICR小鼠，24h后撲殺實驗小鼠，提取心、肝、脾、肺、腎、腦、血液、小腸、肌肉等組織DNA，用建立的ASFV核酸納米金擴增法檢測p72靶基因，并用PCR方法進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示:兩種檢測方法的結(jié)果相符，提示建立的ASFV核酸納米金擴增檢測方法可用于感染組織中ASFV核

7、酸的檢測。
　　2.檢測ASFV抗體間接ELISA的建立
　　為了獲得用于ASFV抗體檢測的重組抗原，分別將免疫原性強且序列保守的ASFVpA104R、pB602R、p54和pK205R基因插入原核表達(dá)載體pET-30a，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a-A104R、pET30a-B602L、pET30a-p54和pET30a-K205R轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，重組菌能表達(dá)

8、預(yù)期大小的19KDa、75 KDa、21 KDa、25KDa重組蛋白。用鎳柱親和層析法純化四種重組蛋白，以ASFV陽性血清進(jìn)行Western-blotting檢測，結(jié)果顯示，四種重組蛋白均能與ASFV抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。用上述四種重組蛋白檢測ASFV感染后不同時間的豬血清，發(fā)現(xiàn)pB602R、p54和pK205R具有較好的檢測效果，在此基礎(chǔ)上建立了多抗原檢測ASFV抗體的間接ELISA(MA-ELSA)，用該方法檢測實驗性感染ASFV的豬

9、血清，其特異性為92.1％（95％ CI，85.0％-96.5％），敏感性為98.2％(95％ CI，93.8％-99.8％);與OIE驗證的ELISA(OIE-ELISA)以及兩個商品化的ELISA試劑盒(ID Vet-ELISA、Ingenasa-ELISA)相比，120份Western blotting驗證過的血清中，MA-ELISA符合率為93.3％（κ=0.86），OIE-ELISA符合率為88.3％(κ=0.74)，Inge

10、nasa-ELISA符合率為84.2％(κ=0.64)，ID Vet-ELISA符合率只有66.7％（κ=0.18），分析MA-ELISA高符合率的原因，發(fā)現(xiàn)該檢測方法能有效檢測弱陽性的ASFV抗體。檢測來自剛果的48份ASFV抗體陽性血清，結(jié)果進(jìn)一步證實了MA-ELISA高準(zhǔn)確性的特點。由此可見，建立的MA-ELISA檢測效果良好，可替代傳統(tǒng)的ASF血清學(xué)診斷方法。
　　3.ASFV抗體膠體金快速診斷方法的建立
　　用純化

11、的ASFV p54重組蛋白肌肉注射健康豬，每隔一周免疫一次，在第三次免疫后第7天采血分離血清，經(jīng)間接ELISA檢測證明抗體滴度達(dá)到105-6。在最適抗原用量為5μg、最佳標(biāo)記pH為pH8.0條件下，用重組蛋白p54標(biāo)記膠體金顆粒吸附玻璃纖維膜，以0.2mg/mL葡萄球菌A蛋白和1mg/mL抗p54多抗分別噴涂硝酸纖維素膜作為檢測線和質(zhì)控線，按照一定的順序組裝成試紙條，建立了快速檢測ASFV抗體的膠體金間接免疫層析方法。經(jīng)檢測，該試紙與C