結(jié)核病的實驗室診斷技術(shù)及應(yīng)用

1、結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)及應(yīng)用,全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情急劇惡化 全球1/3人口（約20億）已感染了結(jié)核菌， 人口的大規(guī)模流動 結(jié)核病與艾滋病同時流行 結(jié)核菌耐多藥菌株的出現(xiàn)我國是世界上僅低于印度和印尼的第三結(jié)核病大國 患病率高， 新發(fā)患者93萬/年，結(jié)核菌感染率為約40％ 死亡率高，每年死亡人數(shù)達13萬 耐藥率高早期快速診斷與治療成為制約結(jié)核病防控的關(guān)鍵因素 常規(guī)結(jié)核病實驗室檢測

2、方法診斷陽性率不到60％。 《摘自2014年中國結(jié)核病監(jiān)測報告》,結(jié)核病檢測技術(shù)發(fā)展歷程,靈敏度低檢測周期長成本低,交叉污染儀器要求復(fù)雜反應(yīng)抑制,高靈敏度高特異性交叉污染少,血清學檢測WHO不推薦r-干擾素釋放實驗,結(jié)核病檢測技術(shù)發(fā)展歷程,一、細菌法 直接涂片（陽性率低—5000以上細菌/ml；不能區(qū)分真假、死活）,,,一、

3、細菌法 結(jié)核菌的培養(yǎng),結(jié)核病病原學診斷的金標準 (培養(yǎng)時間長是其軟肋),,,一、細菌學檢測的新方法　　　—提高陽性率,發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED）液體培養(yǎng)（可同時縮短培養(yǎng)時間）自動化涂片/染色技術(shù)（夾層杯法）,不能區(qū)分真假、死活；培養(yǎng)仍是金標準但耗時長、,分枝桿菌固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)比較,液體培養(yǎng)在提高陽性率、縮短報陽時間上均優(yōu)于固體培養(yǎng)。,吳學兵，陸彬，桂曉虹等。液體MGIT培養(yǎng)法在結(jié)核分枝桿菌檢測中的應(yīng)用評

4、估。檢驗醫(yī)學，2013,3（28）：211-214,仍然不能滿足臨床快速診斷的需要,二、免疫學檢測,血清學檢測（抗體、抗原）結(jié)核菌素試驗（靈敏度、特異性？）結(jié)核感染T細胞檢測（γ-干擾素檢測）,WHO關(guān)于血清學檢測聲明,2011年7月20日，世界衛(wèi)生組織（ WHO ）正式聲明，要求禁止將 血清學檢測方法 （抗原，抗體，蛋白芯片等）用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷。,WHO warns against the use of inaccu

5、rate commercialserological tests for pulmonary and extra-pulmonaryTB.,蛋白質(zhì)組學的發(fā)展 3、4、7種結(jié)核桿菌優(yōu)勢表位抗原（16KD、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、 Mtb16.3）制備多靶點蛋白微陣列 大量的文獻報道其敏感性特異性均顯著高于涂片與培養(yǎng)法

6、 可用于結(jié)核病的臨床輔助診斷，提高痰涂片和痰培養(yǎng)假陰性的檢測率,,,,參考文獻略,,γ-干擾素釋放實驗（IGRAs),10,Interferon-Gamma Release Assays,,結(jié)核桿菌特異抗原：ESAT-6與CFP10,由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失RD1和RD2絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌(NTM)也不存在RD1和RD2區(qū),11,ESAT-6 :

7、 早期抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6）CFP10 : 培養(yǎng)濾液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10）,12,結(jié)核桿菌特異抗原：ESAT-6與CFP10,,準確—T-SPOT臨床診斷性能,特異性只針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng)美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1

8、%(478/508) 靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655),13,T-SPOT相關(guān)指南,T-SPOT®.TB是采用γ-干擾素釋放試驗（IGRA）原理，獲得美國FDA認證、歐盟CE認證和首個中國CFDA認證的商業(yè)化產(chǎn)品列入歐美25個國家結(jié)核診療指南 2011年英國NICE指南、2010

9、年美國最新結(jié)核診療指南、 2010年加拿大結(jié)核指南美國CDC推薦—卡介苗（BCG）接種人群結(jié)核感染檢測首選 國內(nèi)風濕科和消化科已列入專家共識,14,快速—T-SPOT的實驗步驟,,15,,實驗效果圖,一個斑點=一個結(jié)核效應(yīng)淋巴細胞,,T-SPOT結(jié)果的解讀-陽性結(jié)果,活動性結(jié)核病 — 典型結(jié)核中毒癥狀 — 影像學支持 — 排除其他診斷MTB感染狀態(tài) — 典型結(jié)核中毒癥狀 — 未發(fā)現(xiàn)結(jié)核患病證據(jù),潛伏性

10、結(jié)核感染 — 無結(jié)核中毒癥狀 — 無其它結(jié)核患病證據(jù)陳舊性結(jié)核 — 無結(jié)核中毒癥狀 — 既往TB史或明確TB證據(jù),NTM（四種）感染,高孟秋 ，γ-干擾素釋放試驗檢測結(jié)果的臨床意義解讀，中華結(jié)核和呼吸雜志，2014,,T-SPOT結(jié)果解讀-陰性結(jié)果,除外結(jié)核感染 — 所用抗原為MTB特異性抗原 — 機體沒有結(jié)核特異抗原致敏的T淋巴細胞 — 目前未感染結(jié)核分枝桿菌,假陰性：感染階段不同（窗口期

11、）少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/基礎(chǔ)疾病的情況，如HIV感染者、腫瘤患者、嬰幼兒等特殊肺外結(jié)核：結(jié)核性腦膜炎、粟粒性結(jié)核靈敏度相對較低實驗非正常操作：細胞計數(shù)不夠等,高孟秋 ，γ-干擾素釋放試驗檢測結(jié)果的臨床意義解讀，中華結(jié)核和呼吸雜志，2014,T-SPOT的應(yīng)用,優(yōu)點：使用血液標本，取樣簡單；可用于肺內(nèi)和肺外結(jié)核檢測；陰性預(yù)測值很高，可用于排除結(jié)核感染。缺點： 陽性預(yù)測值約80%，不能用于結(jié)核的確診 不能確定是否是肺結(jié)核

12、（肺外） 不能區(qū)分是活動性和潛伏性結(jié)核不能區(qū)分某些非結(jié)核分枝桿菌（堪薩斯、蘇氏、戈登、海 分枝桿菌） 操作復(fù)雜，時間長；對于原發(fā)感染初期或免疫低下人群，可能存在假陰性。,,能否療效監(jiān)測？——無大量數(shù)據(jù),三、結(jié)核DNA檢測技術(shù),測序——金標準熒光定量 PCR環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法（LAMP）基因芯片檢測鑒定技術(shù)基因Xpert MTB/RIF檢測技術(shù),1. 熒光定量 PCR,是應(yīng)用最為廣泛的TB-DNA定量PCR檢測方法具

13、有靈敏度高（10CFU/ml）、特異性強、線性關(guān)系好、操作簡單等優(yōu)點。,2.環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法（LAMP）,是在恒溫下進行PCR擴增，因此操作更為簡便，反應(yīng)更加快速。65℃擴增40min即可用肉眼觀察結(jié)果。擴增陽性標本呈現(xiàn)綠色熒光，反之為陰性。是結(jié)核分枝桿菌DNA檢測技術(shù)的代表-靈敏、快速、特異、簡捷將會極大地推動結(jié)核病的防治工作,,DNA檢測---LAMP,結(jié)果判讀：顯色目測或SYBR Green I等熒光染料,LAMP法和其他PC

14、R法的比較,LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用,臨床試驗,—— LAMP法和對照試劑（BD快速培養(yǎng)）對比結(jié)果,靈敏度＝89.54% 陽性結(jié)果預(yù)期值＝98.13% 特異性＝98.93% 陰性結(jié)果預(yù)期值＝93.77% 總符合率＝95.31%,26,,Journal of Clinical Microbiology. 2010, 48(10): 3654–3660.,通量：可同時檢測 16-22種常見分枝桿

15、菌速度：6小時 靈敏度： 103 CFU/ml可自動或肉眼判讀結(jié)果,3. 基因芯片檢測技術(shù),檢測全程僅需6小時,同時鑒定MTC與21種NTM,,,4.Xpert MTB/RIF檢測技術(shù),GeneXpert應(yīng)用1、TB復(fù)合群鑒定。2、利福平耐藥檢測 。3、WHO推薦4、Xpert®MTB/RIF檢測試劑的陽性檢出率低于人們對分子生物學診斷試劑高敏感度的預(yù)期值，（1000CFU/ml）,DNA用于臨床檢驗的不足,“

16、死菌檢測呈陽性”，與臨床相關(guān)性差不能區(qū)分“潛伏感染”“活動性感染” 易交叉污染 反應(yīng)易受抑制,NASBA（國外）TMA（國外）SAT（國內(nèi)）,四、常見的RNA檢測技術(shù),SAT技術(shù)是將核酸恒溫擴增和實時熒光 檢測相結(jié)合的一種新型RNA檢測技術(shù)。,TB—SAT 檢測技術(shù),TB-SAT操作流程,50 µl 稀釋液,全程2小時，會做PCR，就學的會SAT,TB-SAT檢測技術(shù)優(yōu)點,RNA診斷技術(shù)的優(yōu)勢,靈敏度高：R

17、NA ≥ DNA拷貝數(shù)與臨床相關(guān)性好：區(qū)分“死活菌”： 減少抗生素濫用可以診斷“活動性感染”： 活動性感染：RNA轉(zhuǎn)錄活躍 潛伏感染：RNA不轉(zhuǎn)錄不易污染：靶標和擴增產(chǎn)物都是RNA,TB-SAT檢測區(qū)分MTB和NTM,,結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTB）：人型結(jié)核分枝桿菌牛型結(jié)核分枝桿菌非洲型結(jié)核分枝桿菌,,非結(jié)核分枝桿菌（NTM）：研究表明，TB-SAT可以區(qū)分如下NTM：堪薩斯分枝桿菌、胞內(nèi)分

18、枝桿菌、龜分枝桿菌、戈登分枝桿菌、海分枝桿菌等18種,,Novel Real-Time Simultaneous Amplification and Testing Method To Accurately and Rapidly Detect Mycobacterium tuberculosis Complex J.Clin.Microbiol.2012,50(3):646.DOL:10.1128/JCM.05853-11.,活菌檢測

19、技術(shù)，可用作肺結(jié)核治療效果評估,據(jù)文獻報道：每個結(jié)核分枝桿菌含有約2000個拷貝rRNA研究表明：rRNA與結(jié)核分枝桿菌的生活力有著很好的相關(guān)性， rRNA可以反映結(jié)核分枝桿菌的死菌活菌狀態(tài)研究表明：在用藥治療期內(nèi)，隨著結(jié)核分枝桿菌的死亡，rRNA大約在7天左右時間全部降解。而DNA含量幾乎保持不變,VIVIAN JONAS,et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Sept.1993,

20、p.2410-2416CLAUDIO PIERSIMONI, et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.1997, p.193–196.GABRIELLE M. E. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Sept. 1994, p. 1959-1965,免疫法常有既往感染問題,SAT更有利于治愈判斷,,,窗口期,時間示意,相對濃度示意,,,,抗體

21、,RNA,DNA,病原體感染前后各檢測靶標的含量變化,死菌的RNA快速降解，有助治愈判斷,,,,用藥治療,DNA需要一段時間降解,RNA快速降解,相比DNA,RNA檢測能更好的體現(xiàn)療效,服用利福平和氧氟沙星后，第三天和第七天DNA和RNA的滴度變化，相比DNA,RNA與藥物濃度變化的符合率更高，RNA檢測能更好的進行療效評估。,GABRIELLE M. E. Assessment of Mycobacterial Viability

22、 by RNA Amplification. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Sept. 1994, p. 1959-1965,DNA,RNA,SAT與培養(yǎng)的監(jiān)測結(jié)果一致，可應(yīng)用于療效評估,胡永領(lǐng)，劉成永，成松. 應(yīng)用RNA恒溫擴增實時熒光檢測技術(shù)觀察抗結(jié)核藥物的療效. 海峽藥學,2015年第27卷第1期,,,SAT在抗結(jié)核治療藥物效果檢測方面，雖不能直接作出藥物敏感試驗，但可以最快地直接

23、判斷所用藥物的療效，及時調(diào)整藥物使用，可大大降低醫(yī)療成本和耐藥產(chǎn)生的機會，大幅度減少醫(yī)療時間和費用。,TB-SAT檢測體液、病灶組織標本的靈敏度,蔡杏珊, 馬品云, 張院良，譚耀駒   中國防癆雜志, 2014,36(6): 458-461,小結(jié),TB-SAT是國內(nèi)唯一的結(jié)核分枝桿菌RNA檢測產(chǎn)品，2小時報告結(jié)果，可以快速對開放性肺結(jié)核患者進行排查。TB-SAT可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌，準確鑒別出肺結(jié)核患

24、者。中國防癆協(xié)會與結(jié)核病權(quán)威專家推崇TB-SAT用于早期發(fā)現(xiàn)傳染性肺結(jié)核，減少肺結(jié)核導(dǎo)致的公共衛(wèi)生安全問題。,美國CDC關(guān)于RNA檢測技術(shù)在TB診斷的指南,1996：美國首個結(jié)核病的RNA檢測技術(shù)通過FDA認證，配合培養(yǎng)法對涂陽患者進行診斷2000：美國CDC指出RNA檢測技術(shù)用于TB疑似患者(涂陽、涂陰)痰液檢測、DNA檢測技術(shù)僅用于涂陽患者的痰液檢測2009：更新關(guān)于分子診斷技術(shù)在TB實驗室診斷的指南 至少一個痰液樣本使

25、用分子診斷技術(shù)檢測TB實驗室初步診斷同時參照分子診斷和涂片的結(jié)果,中國結(jié)核病診斷專家共識,結(jié)核病診斷專家組：莊玉輝、萬利亞潘毓瑄、成詩明趙雁林、王國治吳雪瓊、萬康林周林、許衛(wèi)國居金良、胡忠義,專家共識：TB-SAT顯著提高結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率，對早期發(fā)現(xiàn)傳染性肺結(jié)核患者，控制結(jié)核病傳染源有極其重要的意義,中國防癆協(xié)會，2012年6月,結(jié)核實驗室檢測方法中推薦SAT,胡忠義. 實驗結(jié)核病學. 軍事醫(yī)學科學出版社. 2

26、014.趙雁林. 結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程. 中國防癆協(xié)會. 2015,五、耐多藥結(jié)核病診斷現(xiàn)狀,47,固液體培養(yǎng)（時間、生物安全等）,分子生物學技術(shù)應(yīng)用使快速檢測耐藥成為可能,,MDR、XDR的出現(xiàn)對結(jié)核病的防控提出了嚴峻的考驗,結(jié)核耐藥分子診斷技術(shù),測序（金標準-檢測突變的理想方法）實時熒光PCR探針溶解曲線法實時PCR技術(shù)（Gene Xpert）線性探針雜交（Hain LPA）基因芯片（Gene chip）,48,,檢測已

27、知的突變位點,耐藥分子診斷檢測的靈敏度：103CFU/ml,結(jié)核病耐藥與基因,64-68% rps L 基因突變,70% emb B基因突變,,,,,,70%,65%,耐藥基因,93%,95%,95% rpo B基因突變,利福平,異煙肼,50-70% kat G基因突變5-10% inh A基因突變6-13% ahp C基因啟動子區(qū)域突變,鏈霉素,乙胺丁醇,多數(shù)研究報告提示：耐藥的發(fā)生與結(jié)核桿菌的基因突變有關(guān)?？傮w上是基因

28、一個或幾個核苷酸突變（表現(xiàn)增加、缺失、替代），造成核苷酸編碼錯誤致氨基酸錯位排列，影響藥物與靶位酶結(jié)合產(chǎn)生耐藥,結(jié)核耐藥分子診斷技術(shù),測序-與標準序列進行比照檢測未知的突變位點（金標準-檢測突變的理想方法；設(shè)備、檢測的費用昂貴）實時熒光PCR探針溶解曲線法-檢測利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇已知的耐藥突變位點-2小時實時PCR技術(shù)（Gene Xpert）-實時熒光定量PCR技術(shù)檢測rpoB基因突變確定利福平耐藥性，鑒定是否結(jié)核-1

29、小時,50,結(jié)核耐藥分子診斷技術(shù),線性探針雜交（Hain LPA）-PCR擴增后的產(chǎn)物與預(yù)先固化在膜上的特異性探針雜交，檢測rpoB、katG和inhA基因突變位點,診斷利福平和異煙肼耐藥性-8小時基因芯片（Gene chip）-可檢測四種一線藥物（利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇）13種突變位點-6小時,51,核心基因芯片技術(shù),,生物素,鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物,,,:,,,,耐藥突變基因鑒定,同時鑒定4種一線藥物5個基因13個

30、位點,總結(jié)——肺結(jié)核診斷建議,疑似患者的診斷,,陽性,SAT,陰性,,,確診結(jié)核,T-SPOT,,,,,陽性,陰性,80%可能是結(jié)核，需其他方法進一步檢查,排除結(jié)核（原發(fā)初始患者免疫力低下，不能排除）需其他方法作為輔助手段,療效監(jiān)測： 確診結(jié)核患者的用藥療效，1個月或2個月使用SAT判斷。培養(yǎng)作 為輔助手段。,上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點 實 驗 室,結(jié) 束 語,盡管結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)研究已取得很大進展