不同種群甘薯莖線蟲對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制劑的敏感性差異及機(jī)理.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑作用的主要靶標(biāo)部位，它們通過抑制AChE對(duì)乙酰膽堿的水解作用，干擾和最終阻斷突觸傳導(dǎo)。有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的廣泛使用已經(jīng)導(dǎo)致許多害蟲產(chǎn)生了明顯的抗藥性。近年來，在我國(guó)一些地區(qū)采用涕滅威防治甘薯莖線蟲(Ditylenchus destructor)，其效果呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。為此，本文以甘薯莖線蟲為研究對(duì)象，采集了河北省不同種群，進(jìn)行了毒力生測(cè)

2、、乙酰膽堿酯酶活力測(cè)定、甘薯莖線蟲乙酰膽堿酯酶三個(gè)基因cDNA全長(zhǎng)的克隆、抗藥性種群的汰選，以及利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了不同種群各乙酰膽堿酯酶基因的相對(duì)表達(dá)水平，明確了當(dāng)前甘薯莖線蟲對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制劑的抗性水平，探討了抗性機(jī)理，證實(shí)了甘薯莖線蟲抗藥性的產(chǎn)生與乙酰膽堿酯酶的過量表達(dá)相關(guān)。具體研究結(jié)果如下： 1、采用浸漬法和沙柱法對(duì)河北省昌黎、涿州、盧龍和撫寧四地的甘薯莖線蟲進(jìn)行了涕滅威、滅線磷、阿維菌素的敏感性測(cè)定。浸漬法結(jié)

3、果表明，昌黎甘薯莖線蟲種群對(duì)涕滅威、滅線磷的LC<,50>分別為891.73mg/L、743.82mg/L，其它三地涿州、盧龍和撫寧甘薯莖線蟲種群對(duì)涕滅威、滅線磷的敏感性均有所降低，與昌黎種群相比較，其對(duì)涕滅威的抗性倍數(shù)分別為4.0、3.5和3.7倍，對(duì)滅線磷的抗性倍數(shù)分別為3.8、2.1和1.6倍；阿維菌素在400 mg/L以下時(shí)，各種群的死亡率均在45％以下，為600 mg/L時(shí)其死亡率陡增，均為90％以上，且無顯著性差異。沙柱法結(jié)

4、果表明，5mg/L的涕滅威和50mg/L的滅線磷對(duì)線蟲的活動(dòng)能力具有很好的抑制作用，50mg/L的阿維菌素抑制作用則相對(duì)較低。 2、在對(duì)不同溫度和鹽濃度的適應(yīng)性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，昌黎種群較其它三地種群對(duì)46℃以下的高溫有較高的耐受力；撫寧種群對(duì)鹽具有較高的耐受力，盧龍和昌黎兩種群線蟲對(duì)鹽的耐受力較低。不同的地理生態(tài)環(huán)境使線蟲具不同的特殊生態(tài)適應(yīng)性。 3、用改進(jìn)的Ellman方法測(cè)定了河北省昌黎、涿州、盧龍和撫寧四個(gè)不同種群甘薯莖

5、線蟲的乙酰膽堿酯酶的生化特性及其對(duì)抑制劑涕滅威和毒扁豆堿的敏感性差異。結(jié)果表明：甘薯莖線蟲AChE至少存在兩種類型，一種類型對(duì)毒扁豆堿的IC<,50>值小于10<'-6>mol/L，另一種類型大于10<'-4> mol/L。當(dāng)抑制劑毒扁豆堿濃度為10<'-6>～10<'-10> mol/L、涕滅威濃度為10<'-5>～10<'-10> mol/L時(shí)，甘薯莖線蟲昌黎種群AChE的敏感性抑制率明顯高于涿州、撫寧、盧龍三地的甘薯莖線蟲種群的A

6、ChE的抑制率。各地種群AChE對(duì)抑制劑敏感性差異是由于甘薯莖線蟲AChE的多態(tài)性和各分子型綜合性改變的結(jié)果。 4、利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)首次克隆了甘薯莖線蟲乙酰膽堿酯酶基因cDNA全序列：Dd-ace-1、Dd-ace-2和Dd-ace-3，提交GenBank登錄號(hào)分別是EF583059、EF583058和EF583057。其長(zhǎng)度分別是2196bp、2425bp和2517bp。這三個(gè)ace基因5’端均存在反式剪接引導(dǎo)

7、序列SL1。其中Dd-ace-1編碼635個(gè)氨基酸，Dd-ace-2編碼734個(gè)氨基酸，Dd-ace-3編碼611個(gè)氨基酸?？寺〉娜齻€(gè)基因都具有乙酰膽堿酯酶的特征：催化三聯(lián)體、膽堿結(jié)合位點(diǎn)、3對(duì)分子內(nèi)二硫鍵橋和保守的芳香族氨基酸殘基等。聚類分析顯示，Dd-ACE-1、Dd-ACE-2、Dd-ACE-3分別與其它線蟲乙酰膽堿酯酶ACE-1、ACE-2、ACE-3同屬一個(gè)支系。 5、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)比較了河北省昌黎、涿州、

8、盧龍和撫寧四地的甘薯莖線蟲AChE基因Dd-ace-1，Dd-ace-2和Dd-ace-3的mRNA表達(dá)水平的差異。涿州、盧龍和撫寧三地種群的ace-1、ace-2和ace-3在轉(zhuǎn)錄水平上不同程度的高于昌黎種群。涿州、盧龍和撫寧三地種群AChE敏感性降低與ace-1、ace-2、ace-3多基因的過量表達(dá)相關(guān)。 6、采用沙柱法對(duì)敏感種群進(jìn)行涕滅威、滅線磷和阿維菌素抗藥性汰選，進(jìn)一步證實(shí)了涕滅威、滅線磷能顯著提高甘薯莖線蟲ace-