不同種群甘薯莖線蟲對乙酰膽堿酯酶抑制劑的敏感性差異及機理.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑作用的主要靶標(biāo)部位，它們通過抑制AChE對乙酰膽堿的水解作用，干擾和最終阻斷突觸傳導(dǎo)。有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的廣泛使用已經(jīng)導(dǎo)致許多害蟲產(chǎn)生了明顯的抗藥性。近年來，在我國一些地區(qū)采用涕滅威防治甘薯莖線蟲(Ditylenchus destructor)，其效果呈現(xiàn)下降的趨勢。為此，本文以甘薯莖線蟲為研究對象，采集了河北省不同種群，進行了毒力生測

2、、乙酰膽堿酯酶活力測定、甘薯莖線蟲乙酰膽堿酯酶三個基因cDNA全長的克隆、抗藥性種群的汰選，以及利用實時熒光定量PCR檢測了不同種群各乙酰膽堿酯酶基因的相對表達水平，明確了當(dāng)前甘薯莖線蟲對乙酰膽堿酯酶抑制劑的抗性水平，探討了抗性機理，證實了甘薯莖線蟲抗藥性的產(chǎn)生與乙酰膽堿酯酶的過量表達相關(guān)。具體研究結(jié)果如下： 1、采用浸漬法和沙柱法對河北省昌黎、涿州、盧龍和撫寧四地的甘薯莖線蟲進行了涕滅威、滅線磷、阿維菌素的敏感性測定。浸漬法結(jié)

3、果表明，昌黎甘薯莖線蟲種群對涕滅威、滅線磷的LC<,50>分別為891.73mg/L、743.82mg/L，其它三地涿州、盧龍和撫寧甘薯莖線蟲種群對涕滅威、滅線磷的敏感性均有所降低，與昌黎種群相比較，其對涕滅威的抗性倍數(shù)分別為4.0、3.5和3.7倍，對滅線磷的抗性倍數(shù)分別為3.8、2.1和1.6倍；阿維菌素在400 mg/L以下時，各種群的死亡率均在45％以下，為600 mg/L時其死亡率陡增，均為90％以上，且無顯著性差異。沙柱法結(jié)

4、果表明，5mg/L的涕滅威和50mg/L的滅線磷對線蟲的活動能力具有很好的抑制作用，50mg/L的阿維菌素抑制作用則相對較低。 2、在對不同溫度和鹽濃度的適應(yīng)性測定發(fā)現(xiàn)，昌黎種群較其它三地種群對46℃以下的高溫有較高的耐受力；撫寧種群對鹽具有較高的耐受力，盧龍和昌黎兩種群線蟲對鹽的耐受力較低。不同的地理生態(tài)環(huán)境使線蟲具不同的特殊生態(tài)適應(yīng)性。 3、用改進的Ellman方法測定了河北省昌黎、涿州、盧龍和撫寧四個不同種群甘薯莖

5、線蟲的乙酰膽堿酯酶的生化特性及其對抑制劑涕滅威和毒扁豆堿的敏感性差異。結(jié)果表明：甘薯莖線蟲AChE至少存在兩種類型，一種類型對毒扁豆堿的IC<,50>值小于10<'-6>mol/L，另一種類型大于10<'-4> mol/L。當(dāng)抑制劑毒扁豆堿濃度為10<'-6>～10<'-10> mol/L、涕滅威濃度為10<'-5>～10<'-10> mol/L時，甘薯莖線蟲昌黎種群AChE的敏感性抑制率明顯高于涿州、撫寧、盧龍三地的甘薯莖線蟲種群的A

6、ChE的抑制率。各地種群AChE對抑制劑敏感性差異是由于甘薯莖線蟲AChE的多態(tài)性和各分子型綜合性改變的結(jié)果。 4、利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)首次克隆了甘薯莖線蟲乙酰膽堿酯酶基因cDNA全序列：Dd-ace-1、Dd-ace-2和Dd-ace-3，提交GenBank登錄號分別是EF583059、EF583058和EF583057。其長度分別是2196bp、2425bp和2517bp。這三個ace基因5’端均存在反式剪接引導(dǎo)

7、序列SL1。其中Dd-ace-1編碼635個氨基酸，Dd-ace-2編碼734個氨基酸，Dd-ace-3編碼611個氨基酸?？寺〉娜齻€基因都具有乙酰膽堿酯酶的特征：催化三聯(lián)體、膽堿結(jié)合位點、3對分子內(nèi)二硫鍵橋和保守的芳香族氨基酸殘基等。聚類分析顯示，Dd-ACE-1、Dd-ACE-2、Dd-ACE-3分別與其它線蟲乙酰膽堿酯酶ACE-1、ACE-2、ACE-3同屬一個支系。 5、采用實時熒光定量PCR技術(shù)比較了河北省昌黎、涿州、

8、盧龍和撫寧四地的甘薯莖線蟲AChE基因Dd-ace-1，Dd-ace-2和Dd-ace-3的mRNA表達水平的差異。涿州、盧龍和撫寧三地種群的ace-1、ace-2和ace-3在轉(zhuǎn)錄水平上不同程度的高于昌黎種群。涿州、盧龍和撫寧三地種群AChE敏感性降低與ace-1、ace-2、ace-3多基因的過量表達相關(guān)。 6、采用沙柱法對敏感種群進行涕滅威、滅線磷和阿維菌素抗藥性汰選，進一步證實了涕滅威、滅線磷能顯著提高甘薯莖線蟲ace-