孕烷X受體配體篩選模型與乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選模型的構(gòu)建.pdf

1、本研究利用共表達(dá)載體pETDuet-1-SRC88-PXRLBD在Escherichiacoli中共表達(dá)SRC88(SRC-1的88個(gè)氨基酸)和PXRLBD，獲得了可溶性表達(dá)的PXRLBD，并根據(jù)PXR與配體的結(jié)合特性，采用平衡透析模型和高效液相色譜法，建立了體外研究PXR和藥物相互作用的新方法，為體外篩選PXR的配體藥物提供了新模型。 一PXRLBD蛋白的表達(dá)1pGEX-4T-1-PXRLBDRosetta(DE3)表達(dá)菌株的

2、構(gòu)建PXRLBD片段通過(guò)BamHⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)的介導(dǎo)插入pGEX-4T-1載體的多克隆位點(diǎn)。此亞克隆過(guò)程在E.coliDH5α中完成，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化。確證和DNA序列測(cè)定確證后，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coliRosetta(DE3)。 2GST-PXRLBD蛋白的表達(dá)與鑒定500mL2×YT培養(yǎng)基中，接種帶有pGEX-4T-1-PXRLBD重組子的Rosetta(DE3)，培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加IPTG(終濃度50μm

3、ol/L)，20-25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10h。 收集細(xì)菌，對(duì)細(xì)菌破碎液，細(xì)菌破碎液上清和細(xì)菌破碎液沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明GST-PXRLBD蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在。 構(gòu)建新的表達(dá)菌株，利用SRC88與PXRLBD的共表達(dá)實(shí)現(xiàn)PXRLBD的可溶性表達(dá)。 3pETDuet-1-SRC88-PXRLBDRosetta(DE3)表達(dá)菌株的構(gòu)建SRC88片段通過(guò)NcoⅠ和HindⅢ位點(diǎn)的介導(dǎo)插入pETDue

4、t-1載體的多克隆位點(diǎn)-1，PXRLBD片段通過(guò)NdeⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)的介導(dǎo)插入pETDuet-1載體的多克隆位點(diǎn)-2(PXRLBDC-端設(shè)計(jì)His-tag以便于蛋白純化)。此亞克隆過(guò)程在E.coliDH5α中完成，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化確證和DNA序列測(cè)定確證后，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coliRosetta(DE3)。 4PXRLBD和SRC88蛋白共表達(dá)500mL含1％葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，接種帶有pETDuet-1-SRC88-PX

5、RLBD重組子的Rosetta(DE3)。培養(yǎng)至OD600為0.6左右，離心去除上清，用500mL含50μmol/LIPTG的2×YT培養(yǎng)基重懸細(xì)菌沉淀，20～25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10h。 5PXRLBD蛋白的純化與鑒定表達(dá)菌液離心去除上清培養(yǎng)液，用1×PBS重懸細(xì)菌沉淀物。細(xì)菌經(jīng)Frenchpressurecellpress破碎后，超聲破碎，隨即高速離心取上清用His·BindResin純化后獲得純化液8mL。 純化液進(jìn)行S

6、DS-PAGE，在分子量34KD附近出現(xiàn)明顯的PXRLBD表達(dá)條帶，在分子量10KD附近出現(xiàn)明顯的SRC88表達(dá)條帶。 純化液進(jìn)行Westernblot分析，一抗為人PXR101-260aa的多克隆抗體，在分子量34KD附近出現(xiàn)明顯的PXRLBD表達(dá)條帶。 純化液經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)得純化液蛋白濃度為(0.411±0.005)g/L。 二PXR配體篩選模型的構(gòu)建將透析袋A和B放入盛有18mL含克霉唑(11

7、.1μmol/L)的1×PBS緩沖液的試管中，透析袋C和D放入盛有18mL含地塞米松(11.1μmol/L)的1×PBS緩沖液的試管中，透析袋A和C內(nèi)均加入2mL，純化的PXRLBD溶液，透析袋B和D內(nèi)均加入2mLHis·BindResinEluteBuffer作為對(duì)照組。 4℃透析，A和B透析12h達(dá)到平衡，C和D透析24h達(dá)到平衡。分別取透析袋袋內(nèi)外的溶液，其中A和C溶液加蛋白酶K(終濃度10μg/mL)4℃消化1h后加甲醇

8、(1:1)沉淀蛋白，并用高效液相色譜法進(jìn)行含量分析，B和D溶液不加蛋白酶K直接加甲醇(1:1)進(jìn)行含量分析。 透析平衡后，袋內(nèi)游離藥物濃度等于袋外游離藥物濃度(即袋外藥物總濃度)，因此透析袋袋內(nèi)與PXRLBD結(jié)合的藥物濃度等于袋內(nèi)藥物總濃度減去袋內(nèi)游離藥物濃度即袋內(nèi)藥物總濃度減去袋外藥物總濃度。以袋內(nèi)藥物峰面積與袋外藥物峰面積的比值A(chǔ)作為表征，結(jié)果表明克霉唑組A=1.382±0.086，表明袋內(nèi)藥物總濃度高于袋外藥物濃度，即PX

9、RLBD與克霉唑發(fā)生結(jié)合，地塞米松組A=1.004±0.012，表明袋內(nèi)藥物總濃度等于袋外藥物濃度，即PXRLBD與地塞米松結(jié)合作用不明顯，模型建立成功。 目前乙酰膽堿酯酶抑制劑已經(jīng)成為治療輕、中度阿爾茨海默氏病的主流產(chǎn)品。經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市的乙酰膽堿酯酶抑制劑共5種：他克林(Tarcrine)、多奈哌齊(Donepezil，E2020)、利伐司替明(Rivastigmine)、加蘭他敏(Galanthamine)和石杉?jí)A甲(Hu

10、perzineA)，但是已有的乙酰膽堿酯酶抑制劑還存在半衰期短、較嚴(yán)重的外周膽堿能系統(tǒng)副作用等缺點(diǎn)，它們的臨床應(yīng)用受到限制。因此，尋找作用時(shí)間長(zhǎng)、副作用小的新一代乙酰膽堿酯酶抑制劑仍是目前AD藥物研究的熱點(diǎn)。 本研究利用HEK293細(xì)胞表達(dá)重組人乙酰膽堿酯酶，通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)研究考察酶活性，建立乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選模型，并應(yīng)用該模型測(cè)定一系列新化合物的抑制活性。 一HEK293細(xì)胞表達(dá)重組人乙酰膽堿酯酶(rhAChE)p

11、CMV-AChE由HebrewUniversity的HermonaSoreq教授贈(zèng)送。pCMV-AChE經(jīng)DNA序列測(cè)定確證AChE部分與AChE結(jié)構(gòu)基因序列(GenBankAccessionNo：NM_000665)一致。利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofectamineTM2000介導(dǎo)pCMV-AChE瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，rhAChE分泌表達(dá)至細(xì)胞培養(yǎng)液中，收集細(xì)胞培養(yǎng)液作為酶液分析AChE活性。 二酶活性研究 采用改

12、進(jìn)的Ellman方法：反應(yīng)體系中加入酶液和顯色劑DTNB(5,5'-二硫代雙-2-二硝基苯甲酸)，37℃孵育5min，加入底物ATCh(碘化硫代乙酰膽堿)37℃孵育一定時(shí)間，加入SDS終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在412nm處測(cè)定吸光度(OD值)，酶反應(yīng)速率v用OD/min表示。 1酶底物動(dòng)力學(xué)研究反應(yīng)速率對(duì)不同底物濃度作圖得底物濃度曲線，通過(guò)底物濃度曲線確定反應(yīng)體系中底物濃度條件。反應(yīng)速率對(duì)不同酶量作圖得酶量曲線，通過(guò)酶量曲線確定反應(yīng)體

13、系中酶量條件。反應(yīng)速率對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間作圖得反應(yīng)時(shí)間曲線，通過(guò)反應(yīng)時(shí)間曲線確定反應(yīng)體系中孵育時(shí)間條件。 米氏常數(shù)Km測(cè)定的酶促反應(yīng)條件：pH7.4，酶量4μL，底物濃度：0.075，0.1，0.125，0.175，0.25，0.3μmol/L，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間15min，酶反應(yīng)速率v用OD/min表示，1/v對(duì)1/[S]作圖獲得Lineweaver-Burk圖并回歸分析得到Km值為151.9μmol/L。 2酶活力

14、測(cè)定 酶活力計(jì)算公式：U(μmol/min)=V×A/(ε×L)計(jì)算，A表示吸光度隨時(shí)間的變化率(1/min)，V表示反應(yīng)總體積，消光系數(shù)ε=13.6L/mmol/mm，光程L=10mm。 1.6mL反應(yīng)體系：pH7.4，酶量32μL，底物濃度1.25mmol/L，反應(yīng)溫度37℃，在412nm處測(cè)定OD值，每隔0.5min讀數(shù)，連續(xù)測(cè)定3min。反應(yīng)測(cè)得A=0.05934/min，rhAChE酶活力為0.698mU(μm

15、ol/min)。 3酶抑制作用動(dòng)力學(xué)研究多奈哌齊是AChE的可逆性抑制劑，多奈哌齊對(duì)AChE的抑制作用為競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的混合類型，酶抑制常數(shù)Ki和Ki'通過(guò)二次作圖法獲得：不同抑制劑濃度下進(jìn)行Lineweaver-Burk作圖(一次作圖)獲得一系列曲線，一次作圖各系列的斜率對(duì)[I]進(jìn)行二次作圖獲得Ki，縱軸截距對(duì)[I]進(jìn)行二次作圖獲得Ki'。 反應(yīng)體系條件：pH7.4，酶量4μL，多奈哌齊濃度：0，2.5，5.0，

16、10，20，40，80nmol/L，底物濃度：0.065，0.125，0.25，0.5μmol/L，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間15min，通過(guò)二次作圖法測(cè)得Ki=16.03nmol/L，Ki’=18.36nmol/L。 三酶抑制劑篩選模型的建立和應(yīng)用1多奈哌齊IC50的測(cè)定多奈哌齊是AChE的可逆性抑制劑，文獻(xiàn)報(bào)道IC50為14.0nmol/L。選擇7個(gè)濃度測(cè)定多奈哌齊對(duì)rhAChE的抑制率，以化合物摩爾濃度的負(fù)對(duì)數(shù)與酶抑制率進(jìn)行

17、線性回歸求取IC50值。 反應(yīng)體系條件：pH7.4，酶量4μL，多奈哌齊濃度：0，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0nmol/L，底物濃度：0.125mmol/L，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間15min。結(jié)果測(cè)得多奈哌齊IC50=14.0nmol/L。 2新化合物IC50的測(cè)定新化合物來(lái)源：多奈哌齊中的二甲氧基茚酮(與AChE外周位點(diǎn)結(jié)合)和利伐司替明的芐基胺(與AChE中心位點(diǎn)結(jié)合)用氧原子連