基于細胞膜片技術構建血管化組織工程骨的實驗研究.pdf

1、實驗一骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及多向誘導分化
　　[摘要]目的：體外獲取兔骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）、純化、擴增，同時探討其生物學特性及多向分化潛能。方法：全骨髓貼壁法體外分離培養(yǎng)MSCs，觀察其增殖、生長特性和組織學形態(tài)；并向成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞多向誘導分化，分別采用鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色、油紅O染色和甲苯胺藍染色鑒定。結(jié)果：貼壁的骨髓間充質(zhì)干細胞為紡錘形，呈克隆樣生長，性狀穩(wěn)定，

2、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）染色弱陽性。經(jīng)成骨、成脂和成軟骨誘導培養(yǎng)后，表現(xiàn)出相應細胞的形態(tài)學和生物學特征。結(jié)論：全骨髓貼壁篩選法取材方便，骨髓間充質(zhì)干細胞增殖能力強，在不同的條件培養(yǎng)基誘導下能夠多向分化。
　　實驗二內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)和鑒定
　　[摘要]目的：探索分離純化及體外培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)的方法，并進行鑒定。為采用EPCs促進

3、血管化組織工程骨的構建策略提供實驗基礎。方法：將骨髓單核細胞(mononuclearcells,MNCs)接種至明膠涂層的培養(yǎng)皿內(nèi)，使用含10％胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS）、添加50μg/mLECGS(endothelialcellgrowthsupplements)的M199培養(yǎng)液，置37℃、體積分數(shù)為5％的CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3天后棄去未貼壁細胞，此后每3天換液1次。形成內(nèi)皮祖細胞克隆后，0.05％

4、胰酶-EDTA消化傳代，2-4代細胞用于實驗。通過CD31免疫熒光染色、荊豆凝集素免疫細胞化學染色、毛細血管腔形成能力及透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,TEM)檢測進行鑒定。結(jié)果：培養(yǎng)5-7天，內(nèi)皮祖細胞的早期克隆形成，中央為大量圓形細胞。2周后，細胞表現(xiàn)出典型的“鵝卵石”狀。培養(yǎng)過程中可形成管腔狀結(jié)構?？膳c荊豆凝集素特異性相結(jié)合；內(nèi)皮細胞特異性表面標志CD31熒光染色呈陽性表達；透射電鏡觀

5、察細胞質(zhì)內(nèi)見內(nèi)皮細胞特有的細胞器-(W-P)小體。結(jié)論：特定的培養(yǎng)條件下可以獲取足量的EPCs，細胞可迅速體外擴增，并具有內(nèi)皮細胞特異性標志物。
　　實驗三骨髓間充質(zhì)干細胞膜片的體外構建及成骨分化研究
　　[摘要]目的：探索體外構建骨髓間充質(zhì)干細胞膜片的簡便方法，分析膜片組織學結(jié)構，并評估其成骨分化潛能。方法：將兔MSCs高密度接種于直徑10cm培養(yǎng)皿，成骨誘導條件下連續(xù)培養(yǎng)2周形成細胞膜片。收獲時，使用細胞刮沿皿底小心刮起

6、，或用鑷子輕輕提起。通過組織學、組織化學、堿性磷酸酶活性定量檢測、透射電鏡、掃描電鏡(scanningelectronmicroscope，SEM)等一系列方法，檢測細胞膜片的物理及生物學特性。.結(jié)果：高密度連續(xù)培養(yǎng)后形成的MSCs膜片，呈半透明薄膜狀，有彈性，其內(nèi)多個白色結(jié)節(jié)。HE染色證實骨髓間充質(zhì)細胞膜片是一種由多層細胞和細胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）組成的聚集體。堿性磷酸酶、茜素紅及Vonkossa等

7、組織化學染色呈陽性；堿性磷酸酶定量分析含量較高；掃描電鏡及透射電鏡檢查均見基質(zhì)中大量的礦化結(jié)節(jié)聚集。結(jié)論：通過體外簡單的連續(xù)培養(yǎng)方法和成骨誘導后，可構建具有良好成骨能力MSCs膜片。
　　實驗四骨髓間充質(zhì)干細胞膜片復合內(nèi)皮祖細胞構建血管化組織工程骨
　　[摘要]目的：探討利用MSCs膜片復合EPCs構建血管化的無外支架組織工程骨的可行性,以解決傳統(tǒng)接種方法存在的諸多問題。方法：將骨髓細胞行雙向誘導：骨髓單核細胞中MSCs連續(xù)

8、培養(yǎng)成骨誘導后，細胞增殖、分泌細胞外基質(zhì)，形成成骨性膜片；另一部分骨髓單核細胞在內(nèi)皮生長培養(yǎng)基內(nèi)分化為EPCs。然后將MSCs膜片復合EPCs，折疊、卷曲成圓柱狀的復合細胞聚集體。最后，將復合體移植至免疫缺陷的裸鼠背部皮下。單純MSCs膜片構建組織塊作為對照。術后4周，8周分別進行大體觀察、顯微CT（micro-computedtomography，Micro-CT）、掃描電鏡及組織學檢查。結(jié)果：MSCs膜片復合EPCs構建物植入體內(nèi)后

9、，形成血管化骨樣組織，外觀色紅、質(zhì)硬。CT、掃描電鏡及組織學檢查均證實新骨形成，而且所形成的骨密度和血管密度均高于對照組。結(jié)論：首次利用MSCs膜片復合EPCs構建較大體積的血管化組織工程骨，無需外支架。實驗證實EPCs的引入不僅能產(chǎn)生功能性血管網(wǎng)，而且能夠促進骨形成。
　　實驗五骨髓間充質(zhì)干細胞膜片復合內(nèi)皮祖細胞構建可注射血管化組織工程骨
　　[摘要]目的：探討可注射的血管化組織工程新的構建策略。方法：利用MSCs膜片復合

10、EPCs，形成具有雙重細胞成分的聚集體。復合種子細胞附著于自身分泌的細胞外基質(zhì)支架上，形成具有骨組織三維結(jié)構和生理活性的復合體。再注射至無免疫動物背部皮下，術后4周，8周分別進行大體觀察、顯微CT、掃描電鏡及組織學檢查，觀察其在體內(nèi)發(fā)育成骨樣組織的能力。結(jié)果：MSCs膜片/EPCs復合體，可以順利通過注射針頭至皮下。8周后形成鮮紅骨樣組織，呈扁圓形，外周密布一層血管網(wǎng)，質(zhì)地硬，最大長度近2.0cm。Micro-CT影像顯示高密度礦化組織

11、形成。橫斷面掃描電鏡觀察呈現(xiàn)松質(zhì)骨樣結(jié)構，其內(nèi)大量片狀骨小梁排列，交織為多孔的網(wǎng)格樣結(jié)構。組織學檢查證實新生的骨組織和豐富的血管形成。此外，新骨的形成存在兩種方式：組織塊外周以膜內(nèi)骨化為主，骨基質(zhì)內(nèi)可見骨細胞，骨小梁邊緣成行排列矮柱狀的成骨細胞；組織塊內(nèi)部還可見肥大的軟骨細胞和鈣化軟骨，提示軟骨內(nèi)骨化方式。結(jié)論：本研究，首次驗證了將EPCs復合MSCs膜片，構建可注射的血管化組織工程骨的可行性，無需外源性載體。為構建可注射的血管化組織工

12、程骨提供了全新的思路。
　　實驗六骨髓間充質(zhì)干細胞膜片/內(nèi)皮祖細胞/珊瑚構建大塊管狀骨
　　[摘要]目的：利用細胞膜片技術，輔以管狀形態(tài)的內(nèi)支撐體，首次探索移植自體體內(nèi)構建大塊的具備特定形態(tài)的組織工程骨。方法：構建兔來源MSCs膜片-EPCs，與珊瑚內(nèi)支撐體卷層樣復合，形成管樣結(jié)構。體外實驗，置灌注式生物反應器動態(tài)培養(yǎng)8周，觀察細胞生長和組織的形成；體內(nèi)實驗，移植自體背部皮下，利用自體的微環(huán)境和自身分泌的各種生長因子調(diào)控來完

13、成骨組織的構建。體內(nèi)、外標本取材，進行大體觀察、顯微CT、掃描電鏡及組織學檢查，分析新骨形成。結(jié)果：體外，隨著灌注式反應器動態(tài)培養(yǎng)時間的增長，細胞基質(zhì)分泌旺盛，細胞與細胞產(chǎn)生連接，各層聚集體之間逐漸融合、增厚，質(zhì)地變硬，并與珊瑚材料緊密結(jié)合，呈現(xiàn)出白色的骨樣組織外觀。體內(nèi)培養(yǎng)8周后，構建了長度近5.0cm大塊管狀骨。顯微CT、掃描電鏡及組織學檢查均證實，珊瑚表面、材料間隙及深部均有新骨形成。結(jié)論：MSCs膜片-EPCs與珊瑚自體體內(nèi)可構