納秒電脈沖致人卵巢癌細(xì)胞及其順鉑耐藥株DNA損傷時(shí)間效應(yīng).pdf

1、卵巢癌是女性生殖器常見(jiàn)惡性腫瘤之一，由于早期缺乏典型癥狀，且篩查手段有限，故診斷十分困難，就診時(shí)大多已發(fā)展為晚期，但晚期療效又不理想。雖然卵巢癌的發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤的第三位，低于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但其死亡率卻位于婦科惡性腫瘤的首位。盡管已有多種治療手段應(yīng)用于臨床，但其5年生存率仍較低。順鉑是臨床治療多種腫瘤重要的化療試劑，它的主要作用靶點(diǎn)是DNA。放、化療均通過(guò)損傷腫瘤細(xì)胞DNA來(lái)達(dá)到治療目的，治療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞將逐漸產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致

2、治療失敗。納秒電脈沖（nanosecond electric pulses, nsEP）是一種很有潛力的治療方法，它可跨膜影響細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成以及破壞腫瘤微環(huán)境等，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死。nsEP作為一種不需要藥物的純電場(chǎng)治療，且無(wú)熱消融，有望成為腫瘤治療的一種新型手段。
　　目的：本研究旨在通過(guò)研究nsEP對(duì)人卵巢癌順鉑敏感和耐藥細(xì)胞株DNA損傷的時(shí)間效應(yīng)，探討n(yōu)sEP引起的DNA損傷與細(xì)胞死亡之間的相關(guān)

3、性。
　　方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A2780細(xì)胞或者C30細(xì)胞制備密度為5×105/ml的單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞置于漩渦混勻器上面混勻后取1ml細(xì)胞于24孔板中，每次脈沖處理時(shí)每一個(gè)24孔板只有一個(gè)孔中盛有細(xì)胞。然后調(diào)整電極間距離為1 cm，電壓6 kV（即場(chǎng)強(qiáng)為6 kV/cm），脈寬為24 ns的脈沖電場(chǎng)處理60 s。對(duì)照組細(xì)胞給予假脈沖處理。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。
　　1，脈沖處理完畢后，將24孔板中所有的細(xì)胞回收到E

4、P管中再次混勻以后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。nsEP處理后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞于0 h、4 h、8 h、12 h和24 h用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞活性，并計(jì)算細(xì)胞死亡率。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置有實(shí)驗(yàn)組（nsEP處理后）、對(duì)照組（nsEP假處理）和空白對(duì)照組（不含細(xì)胞，僅加入100μl實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基）。
　　2，nsEP處理后4 h、8 h、12 h、24 h，采用堿性單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)（彗星實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷。利用CASP軟件測(cè)定對(duì)照組尾DNA的95

5、th百分位數(shù)設(shè)置為彗星形成的閾值。并測(cè)量實(shí)驗(yàn)組75th百分位數(shù)尾長(zhǎng)(Tail Length, TL)，尾矩(Tail Moment, TM，尾部DNA％×尾長(zhǎng))和Olive尾矩(Olive Tail Moment, OTM，尾部DNA%×尾矩長(zhǎng))，并計(jì)算彗星形成率（%）。
　　結(jié)果：
　　1，nsEP處理后0-8 h，C30和A2780細(xì)胞的生存率逐漸降低，8-24 h逐漸上升，8 h時(shí)細(xì)胞生存率最低（P＜0.05）：4h（

6、86.46%vs76.29%），8h（78.52% vs65.96%），12h（84.28% vs75.29%），24h（85.11% vs80.87%）。C30細(xì)胞的生存率高于A2780細(xì)胞（P＜0.05）。
　　2，從單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果圖可明顯看出對(duì)照組中 A2780和 C30細(xì)胞均未見(jiàn)彗尾出現(xiàn)。在4h、8h、12h和24h的彗星圖像中，A2780細(xì)胞的尾長(zhǎng)均分別比C30細(xì)胞的長(zhǎng)。這在某種程度上說(shuō)明了A2780細(xì)胞更易受到ns

7、EP的作用而受到損傷。A2780細(xì)胞的死亡率與彗星形成率在4-24 h均高于C30細(xì)胞。這又從另一方面證實(shí)了A2780的敏感性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，A2780和C30細(xì)胞的死亡率均與彗星形成率呈正相關(guān)（ r=0.997， P＜0.05；r=0.998，P＜0.05）。這說(shuō)明細(xì)胞的死亡與DNA損傷具有相關(guān)性。
　　3，A2780和C30細(xì)胞的TL、TM、OTM和其75 th百分位數(shù)均隨時(shí)間變化而變化，最大值出現(xiàn)于8 h。這說(shuō)明細(xì)胞的損傷