寧夏粳稻離體再生體系的建立及HAL1基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、西北粳稻是我國重要的粳稻類型之一，其種植面積小，但地處稻米的優(yōu)質(zhì)氣候生態(tài)帶，日照充足，晝夜溫差大，有利于養(yǎng)分的積累，具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的特點。其中以寧夏尤為突出，該省粳稻單位面積產(chǎn)量在全國粳稻區(qū)多年來一直名列前1至2位，在糧食生產(chǎn)中占有重要地位。通過品種改良不斷提高寧夏粳稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，是促進當(dāng)?shù)丶Z食生產(chǎn)發(fā)展的重要途徑之二。植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的作物定向改良和分子育種新技術(shù)，HAL1基因是釀酒酵母中的重要耐鹽因子，其

2、表達參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)離子濃度，盡管HAL1基因本身不是轉(zhuǎn)運蛋白，但在鹽脅迫下能與ENA1基因協(xié)同作用促進Na+外排，與其它轉(zhuǎn)運系統(tǒng)協(xié)同作用增加K+的吸收，保持細胞內(nèi)低的Na+K+比，以減輕Na+毒害，因而在植物耐鹽基因工程上具有很大的潛力，利用HAL1基因轉(zhuǎn)化寧夏粳稻在提高寧夏粳稻耐鹽特性上有重要的理論和實踐意義。 胚和花藥組織是禾谷類作物遺傳轉(zhuǎn)化中建立離體再生體系的主要外植體。利用成熟胚和花藥組織建立水稻高頻再生體系及進行外源基

3、因遺傳轉(zhuǎn)化的研究已有一些報道，但利用寧夏粳稻成熟胚和花藥培養(yǎng)建立高頻再生體系及進一步進行遺傳轉(zhuǎn)化研究尚未見報道。本研究以寧夏粳稻為試驗材料，通過技術(shù)的優(yōu)化，首先建立了寧夏粳稻高效穩(wěn)定的成熟胚、花藥組織離體培養(yǎng)再生體系；探索并優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寧夏粳稻遺傳轉(zhuǎn)化條件及其影響因素，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將HAL1基因轉(zhuǎn)入寧夏粳稻，對獲得的寧夏粳稻HAL1基因轉(zhuǎn)化株進行了分子生物學(xué)鑒定。主要研究結(jié)果如下： 1.建立并優(yōu)化了寧夏粳稻成熟胚離體培

4、養(yǎng)再生的技術(shù)體系，篩選出了離體培養(yǎng)再生特性較好的寧夏粳稻基因型。研究表明，參試的34個寧夏粳稻品種成熟胚的培養(yǎng)特性差異很大，愈傷組織誘導(dǎo)率在16.0％～87.3％之間，綠苗分化率在0％～68.9％之間；其中優(yōu)育28成熟胚表現(xiàn)出良好的培養(yǎng)特性，愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率分別為87.3％、65.6％；寧粳24、寧粳34成熟胚也表現(xiàn)出較好的培養(yǎng)效果。不同水稻品種成熟胚在N6和NB培養(yǎng)基上培養(yǎng)特性有差異。N6培養(yǎng)基誘導(dǎo)水稻成熟胚組織適宜的2，4

5、-D濃度為2mg/L，且添加0.2-0.5 mg/L的6-BA能夠改善愈傷組織的質(zhì)量，提高愈傷組織出愈率和分化率；麥芽糖和蔗糖為糖源時寧夏粳稻均表現(xiàn)出較好的培養(yǎng)效果，高濃度的蔗糖對愈傷組織分化有利，但對愈傷組織的誘導(dǎo)不利，蔗糖濃度為30-40 g/L時寧夏粳稻的培養(yǎng)效果較好。添加KT2m/L、NAA 1mg/L、IAA 0.5mg/L的Ms培養(yǎng)基有利于寧夏粳稻成熟胚愈傷組織的分化。成熟胚愈傷組織在繼代1～2次對分化培養(yǎng)無顯著影響，繼代3

6、次以上，愈傷組織逐漸變得灰暗、無光澤，生長緩慢，分化效果顯著變差?？傮w而言，寧夏粳稻成熟胚離體培養(yǎng)再生特性最好基因型為優(yōu)育28，愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為N6+2,4-D 2mg/L+6-BA 0.2-0.5 mg/L+水解酪蛋白0.5 g/L+脯氨酸2.8 g/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L(pH5.8)，最佳分化培養(yǎng)基為MS+KT 2mg/L+IAA 1mg/L+NAA0.5mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L+瓊脂

7、粉6g/L(pH5.8)。 2.建立并優(yōu)化了寧夏粳稻花藥離體培養(yǎng)再生的技術(shù)體系。參試的22份材料中3279、花107花藥具有較好的離體培養(yǎng)特性。以A4為誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果優(yōu)于N6。不同基因型的水稻花藥對2,4-D濃度要求不同，N6培養(yǎng)基中，寧夏粳稻適宜的2,4-D的質(zhì)量濃度在1.3 mg/L之間；碳源用蔗糖效果優(yōu)于葡萄糖和麥芽糖，蔗糖濃度為60g/L時培養(yǎng)效果最好；選取溫室種植花藥的培養(yǎng)效果優(yōu)于選取大田種植花藥的培養(yǎng)效

8、果；低溫預(yù)處理8d左右的培養(yǎng)效果最好。故寧夏粳稻花藥離體再生技術(shù)體系方案應(yīng)為：選擇培養(yǎng)特性較好的材料3279、花107，溫室種植，花藥在4℃冰箱內(nèi)低溫預(yù)處理8d，誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為N6+2，4-D 1-3mg/L+KT0.5mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+脯氨酸0.5 g/L+蔗糖60g/L+瓊脂粉6g/L(pH5.8)，分化培養(yǎng)基為MS+KT2.0mg/L+NAAlmg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L(

9、pH5.8)。 3.建立并優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寧夏粳稻成熟胚愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。以優(yōu)育28成熟胚愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化體系中篩選劑Kan的濃度、Cb對愈傷組織的影響以及共培養(yǎng)時間、洗菌、干燥處理等對遺傳轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明，Kan的濃度為250mg/L時愈傷組織均褐化死亡，可以作為參試材料的篩選濃度。Cb的濃度大于600mg/L時明顯抑制了愈傷組織的生長。共培養(yǎng)3d獲得的抗性愈傷組織最多。共培養(yǎng)后，利用加

10、入Cb和Cef各500mg/L的無菌水混合液處理共培養(yǎng)的愈傷組織，對抑制農(nóng)桿菌起到了較好的效果，其抗性愈傷組織獲得率最高。在接種篩選培養(yǎng)基之前，干燥處理可以有效的抑制農(nóng)桿菌的生長和繁殖，提高抗性愈傷組織的獲得率。 4.通過對寧夏粳稻成熟胚、花藥離體再生體系的建立和HAL1農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化水稻的研究，首次建立起了一個有效的寧夏粳稻遺傳轉(zhuǎn)化體系。以優(yōu)育28成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織為受體材料，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)和Kan抗性篩選，共獲得了69個轉(zhuǎn)化植