SPIO、EGFP和SPIO-GFP雙標對大鼠BMSCs成骨、成脂和成肝分化能力的影響.pdf

1、肝功能衰竭是影響人類健康的常見疾病。肝移植是唯一能根除終末期肝病的有效方法，三年生存率達70％～80％，但移植技術(shù)、圍手術(shù)期管理要求高，移植后可能發(fā)生并發(fā)癥，術(shù)后必需長期免疫抑制劑治療，更為不足的是肝源短缺，使肝移植惠及人群有限。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem Cells，BMSCs)是來源于骨髓的一類具有貼壁生長特性并具備多向分化潛能和自我更新能力的細胞，在一定條件下可分化為特定組織類型細胞

2、，包括肝細胞，是治療肝衰竭的理想種子細胞?；铙w狀態(tài)下動態(tài)監(jiān)測植入體內(nèi)BMSCs的存活、遷移乃至分化是BMSCs移植治療推廣至臨床必須解決的一個重要問題。分子影像學(xué)的發(fā)展使活體監(jiān)測移植干細胞的歸巢及功能成為可能。目前用于干細胞活體示蹤的分子影像學(xué)技術(shù)主要包括光學(xué)成像、磁共振成像和核素顯像，各有優(yōu)缺點，因此，聯(lián)合多種影像可以取長補短，充分發(fā)揮分子影像學(xué)的作用，目前已取得一定成果。細胞的活體監(jiān)測離不開細胞標記，超順磁性氧化鐵(superpar

3、amagnetic iron oxide，SPIO)是干細胞MR顯像的一種常用對比劑。增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因標記是光學(xué)成像的常用標記基因。細胞標記是否影響干細胞的多向分化能力特別是向目標細胞分化的能力是再生醫(yī)學(xué)必需關(guān)注的問題，目前尚未見系統(tǒng)全面介紹GFP和/或SPIO標記對干細胞成肝分化能力影響的報道。 研究目的： 實現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞成骨、成脂和成肝多向分化誘導(dǎo)。通過對SPIO標記、增強型GFP標記和SPI

4、O/GFP雙標記干細胞進行成骨、成脂和成肝分化誘導(dǎo)，比較四種細胞誘導(dǎo)分化效果，探討SPIO標記、增強型GFP標記和SPIO/GFP雙標記對于細胞成骨、成脂和成肝分化能力的影響作用，并為課題組后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)。 研究方法： 1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的獲取和鑒定 采用密度梯度離心法和貼壁法獲取大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，采用三代后BMSCs，苔盼藍染色測細胞活力，茜素紅染色檢測細胞成骨分化能力；油紅O染色驗證

5、細胞成脂分化能力。 2、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞高效分化成具備一定肝功能的肝細胞 用Matrigel包被培養(yǎng)皿，以21.5×103/CM2的密度種植BMSCs，在含有肝細胞生長因子、纖維母細胞生長因子—4、表皮生長因子、ITS+1、地塞米松、維生素C、胎牛血清等的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行細胞培養(yǎng)，每三天換液一次。對誘導(dǎo)培養(yǎng)細胞分別從細胞形態(tài)、基因水平、生化水平等進行鑒定。鑒定方法包括光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化，RT—PCR檢測骨髓干細

6、胞標記(骨髓間質(zhì)細胞抗原1，BST-1)，肝細胞早期(M2型丙酮酸激酶，M2-PK；甲胎蛋白，AFP)和晚期標記(白蛋白，ALB)基因變化，細胞免疫化學(xué)染色測AFP、ALB，放免法測上清液白蛋白濃度，生化分析測上清液尿素氮(BUN)濃度，糖原染色測誘導(dǎo)細胞糖原合成和儲存功能。 3、SPIO、EGFP和SPIO/GFP雙標記對MSC成骨、成脂和成肝分化能力的影響 用帶EGFP基因的慢病毒感染干細胞96小時，病毒感染指數(shù)(m

7、ultiplicity of infection，MOI)為20，熒光顯微鏡觀察干細胞熒光標記率，所得EGFP標記細胞記為GFP—MSC；采用25ug/mL SPIO聯(lián)合0.75ug/mL多聚賴氨酸(PLL)孵育48小時標記BMSCs和GFP—MSC，所得標記細胞分別記為SPIO—MSC和SPIO/GFP—MSC。分別對MSC、GFP—MSC、SPIO—MSC和SPIO/GFP—MSC進行成骨、成脂、成肝誘導(dǎo)，比較各指標的差異。除成肝分

8、化鑒定采用實時熒光定量PCR檢測誘導(dǎo)兩周時各組細胞ALB mRNA表達量外，其余方法同第1和第2部分。 研究結(jié)果： 1、密度梯度離心法和貼壁法獲得的骨髓間充質(zhì)干細胞活性高(大于98％)，流式細胞儀檢測細胞表達CD29(89.82％)和CD44(70.15％)，不表達CD45(3.69％)和CD11b(2.93％)。成骨誘導(dǎo)2-3周茜素紅染色見呈橘紅色的鈣鹽沉積；成脂誘導(dǎo)5-9天，油紅O染色顯示誘導(dǎo)細胞內(nèi)紅染的脂滴。

9、 2、成肝誘導(dǎo)后，MSCs增殖減慢，細胞由長梭型逐漸向類肝細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，變?yōu)轭悎A形、三角形、多角形。mRNA水平上，誘導(dǎo)細胞M2-PK、AFP表達先增加后消失，ALB表達逐漸增高，誘導(dǎo)28天BST-1無表達：免疫細胞細胞化學(xué)鑒定：誘導(dǎo)5天、8天細胞AFP染色陽性；誘導(dǎo)14天ALB蛋白染色陽性，隨時間延長陽性率增加；誘導(dǎo)1周起上清液可檢測到BUN和ALB，并有時間依耐性；誘導(dǎo)三周細胞糖原染色即見整個視野呈陽性，四周顏色加深。 3

10、、帶EGFP基因的慢病毒感染MSC標記率達98％.普魯士藍染色顯示25ug/mL SPIO聯(lián)合0.75ug/mL多聚賴氨酸(PLL)孵育48小時對MSC和GFP—MSC標記率可達100％，三種標記細胞活力大于98％；對SPIO—MSC，GFP—MSC，SPIO/GFP—MSC和MSC四種細胞成骨誘導(dǎo)3周后茜素紅染色陽性，成脂誘導(dǎo)5-9天后油紅O染色陽性；對SPIO—MSC，GFP—MSC，SPIO/GFP—MSC和MSC四種細胞進行成肝

11、誘導(dǎo)，細胞增殖速度減慢，形態(tài)學(xué)變化相似，誘導(dǎo)兩周時實時熒光定量PCR顯示ALB mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，誘導(dǎo)8天AFP、誘導(dǎo)14天ALB免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果均見大片胞漿染色陽性表現(xiàn)，上清液白蛋白、BUN濃度均在第7天可檢測到，隨時間上升，2周后達平臺；誘導(dǎo)4周糖原染色均呈大片狀紅染。 結(jié)論： 1、密度梯度離心法和貼壁法是大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離的良好手段，獲取的干細胞純度和活性高，具備成骨、成脂分化能力。