多粘菌素E產(chǎn)生菌高通量誘變育種的研究.pdf

1、多粘菌素E是由多粘桿菌(PaenibacillusPolymyxa)所產(chǎn)生的，由多種氨基酸和脂肪酸所組成的一族堿性多肽類抗生素中的一種，它對各種革蘭氏陰性菌引起的疾病有顯著療效。本論文對多粘菌素E產(chǎn)生菌的高通量誘變育種及發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并取得了良好效果。 建立了多粘菌素E的液相色譜檢測法(HPLC)。通過對流動相中乙腈含量和pH大小及檢測波長等因素的優(yōu)化，多粘菌素E的兩種主要成分多粘菌素E1和多粘菌素E2得到很好的分離

2、。 從原始培養(yǎng)基出發(fā)，分別對種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。在此實驗條件下獲得多粘菌素E產(chǎn)量達(dá)到500mg/L，比優(yōu)化前提高了17％。 建立了基于96微孔板的多粘菌素E產(chǎn)生菌高通量培養(yǎng)方法。優(yōu)化了96微孔板裝液量、搖床轉(zhuǎn)速等培養(yǎng)條件。自行設(shè)計了8層紗布外加有孔聚酯蓋子的方法代替微孔板原始蓋子。以上培養(yǎng)體系水份蒸發(fā)率只有2％，無交叉污染現(xiàn)象，且與搖瓶培養(yǎng)體系具有良好的正相關(guān)性。 建立了96微孔板

3、的多粘菌素E高通量檢測方法。以大腸桿菌JM109為檢定菌，以發(fā)酵液對檢定菌的抑菌活性來確定多粘菌素E的含量。優(yōu)化了初始大腸桿菌懸液濃度、培養(yǎng)時間、樣品加入量等操作條件。研究了以上所建立的高通量測定方法與HPLC方法的聯(lián)系，證實了兩者具有一定的正相關(guān)性。 根據(jù)多粘菌素E生物合成途徑，對多粘菌素E野生型產(chǎn)生菌進(jìn)行推理選育。通過對13,613個突變株的高通量篩選，得到一株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量最高為1,200mg/L的菌株(N6-557)，為出