鋸緣青蟹陰離子抗菌肽SCY2基因克隆、表達(dá)特性及其抗菌活性的研究.pdf

1、本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)室獲得的SCY2部分cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以雄性鋸緣青蟹的性腺組織RNA為模板，利用RT—PCR及5’，3’-RACE等方法，克隆獲得了抗菌肽SCY2的全長(zhǎng)cDNA序列947bp，編碼100個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為10925.4Da，等電點(diǎn)PI為4.84，與已發(fā)表的鋸緣青蟹抗菌肽Scygonadin基因的氨基酸序列相似性為65.08％，因而認(rèn)為SCY2是在鋸緣青蟹中發(fā)現(xiàn)的又一個(gè)新的陰離子抗菌肽。主要結(jié)果如下：

2、 采用PCR及反向PCR等方法，對(duì)基因組DNA及其側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了SCY2基因組DNA的全長(zhǎng)序列，該基因組全長(zhǎng)為2607bp，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。與Scygonadin具有相似的基因結(jié)構(gòu)組成；獲得了SCY2基因的上下游側(cè)翼序列，5’上游序列含有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及TATA box等啟動(dòng)子所具有的特征序列。 用RT-PCR和Northern-blot等方法，分別檢測(cè)了SCY2基因在鋸緣青蟹(雄性和雌性)不同組織器官(

3、鰓、甲殼、眼、血細(xì)胞、肝胰臟、心臟、肌肉、甲殼下皮層、胃和生殖系統(tǒng)等)中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該基因僅在雄性生殖系統(tǒng)中表達(dá)。該表達(dá)特性與Scygonadin相似。檢測(cè)細(xì)菌感染條件下鋸緣青蟹各組織SCY2及Scygonadin表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在感染后48 h內(nèi)，SCY2和Scygonadin mRNA在性腺組織中的表達(dá)水平均無明顯變化，說明外部細(xì)菌感染不是SCY2的直接誘導(dǎo)表達(dá)因素。 為確定SCY2的抗菌功能，根據(jù)SCY2編碼序列，構(gòu)

4、建了pTrc-CKS/SCY2融合基因表達(dá)載體。將表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，通過變性復(fù)性后獲得融合蛋白SCY2-CKS。利用金屬鏊合層析純化獲得SCY2融合蛋白，并以3C蛋白酶酶切獲得重組表達(dá)的SCY2。用0.4mg/ml重組SCY2在11種海洋動(dòng)物病原菌和耐藥性細(xì)菌進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)(細(xì)菌殺傷指數(shù)(KI))，結(jié)果顯示：SCY2能夠選擇性的抑制革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病原菌嗜