shRNA對食管鱗癌EC9706細胞p70S6K1表達的影響.pdf

1、食管鱗癌是我國北方最常見的消化道惡性腫瘤之一,尤其是河南省林縣發(fā)病率最高。手術(shù)治療、化學治療、放射治療以及生物治療為主的綜合治療,使食管癌治療有了較快的發(fā)展。但是,食管鱗癌發(fā)生的確切機理仍然不清楚。因此,如何提高食管鱗癌的早期診斷率,以及抗腫瘤藥物的開發(fā)仍然是個巨大的挑戰(zhàn)。
　　 70 kDa核糖體S6激酶1(70 kDa ribosomal S6 kinase1,p70S6K1)是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian t

2、arget of rapamycin,mTOR)的一個重要的下游靶蛋白,能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長、周期進展和存活。在細胞信號通路網(wǎng)絡中發(fā)揮著復雜的作用。當前研究的熱點主要是mTOR抑制劑,現(xiàn)在有多種mTOR抑制劑已經(jīng)進入臨床試驗,并取得了初步成效。mTOR抑制劑也能夠改變腫瘤的放化療敏感性。而針對p70S6K1的阻斷策略的研究還很少,且p70S6K1的活化水平與mTOR抑制劑的敏感性的關(guān)系還有待進一步研究。
　　 因此,本課題試圖構(gòu)

3、建p70S6K1特異性抑制的短發(fā)夾RNA(short hairpinRNA,shRNA)表達載體,并檢測其對食管鱗狀細胞癌細胞(Esophageal squamouscell careinoma cell,ESCCC)株EC9706細胞p70S6K1 mRNA和磷酸化p70S6K1(phosphated p70S6K1,p-p70S6K1)蛋白表達的影響,而能夠選擇出干擾效果較好的p70S6K1特異性shRNA表達載體,為進一步研究p7

4、0S6K1在細胞內(nèi)的生物學功能提供有效地工具。
　　 方法:
　　 1、shRNA表達載體構(gòu)建
　　 根據(jù)siRNA設計原則,在Ambion公司網(wǎng)站設計并選取3個p70S6K1特異性靶序列,而設計合成正反義DNA片段,3’端添加5個T,作為RNA聚合酶Ⅲ的終止子,兩端加酶切位點。合成的正反義65 nt寡核苷酸鏈經(jīng)退火形成雙鏈DNA(double strand DNA,dsDNA),并與線性的pSIREN-Retr

5、oQ-DsRed-Express載體連接,得到重組質(zhì)粒,分別命名為p1shRNA-p70S6K1、p2shRNA-p70S6K1和p3shRNA-p70S6K1。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌,在氨芐抗性培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng),挑取陽性克隆,送菌液測序鑒定。
　　 2、轉(zhuǎn)染EC9706細胞
　　 根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟,將重組質(zhì)粒p1 shRNA-p70S6K1轉(zhuǎn)染EC9706細胞。實驗分兩組①對照

6、組(無質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染):②實驗組(質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)；轉(zhuǎn)染24 h時在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光表達。
　　 3、RT-PCR
　　 應用RT-PCR實驗分別檢測轉(zhuǎn)染后24、48、72、96和120 h p70S6K1 mRNA表達的變化情況,實驗重復三次。
　　 4、Western blotting
　　 采用Western blotting實驗檢測轉(zhuǎn)染后24、48、72、96和120 h p-p70S6K1表

7、達的變化情況,實驗重復三次。
　　 5、圖像處理和統(tǒng)計學分析
　　 使用圖像處理軟件IPP5.0.2對RT-PCR和Western blotting實驗圖片進行灰度值分析。應用SPSS10.0軟件,采用單因素方差分析方法(one-way ANOVA),P值<0.01有統(tǒng)計學意義；采用最小有意義差異(least significant difference,LSD)t檢驗進行兩兩比較,P值<0.05有統(tǒng)計學意義。
　

8、　 結(jié)果:
　　 1、重組質(zhì)粒的鑒定通過測序鑒定,報告顯:pSIREN-RetroQ-DsRed-Express載體連接序列與設計序列完全相符。
　　 2、熒光表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC9706細胞24 h后,在熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光表達。
　　 3、RT-PCR結(jié)果與對照組相比,p70S6K1 mRNA表達在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h下調(diào)(P值均<0.05),其中,在轉(zhuǎn)染48 h達到最大抑制率,最大干擾

9、效率為55.3％。
　　 4、Western blotting結(jié)果與對照組相比,p-p70S6K1(Th389)表達在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h下調(diào)(P值均<0.05),其中,在轉(zhuǎn)染48 h達到最大抑制率,最大干擾效率約為58.0％。
　　 討論:
　　 本研究應用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建p70S6K1特異性干擾載體。實驗已經(jīng)初步證實:所構(gòu)建得p70S6K1特異性shRNA表達載體,轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞株