重組大腸桿菌毒素蛋白LT-Ⅱc1B-Stx2B-STa13的表達及其誘導(dǎo)小鼠體液免疫的研究.pdf

1、犢牛大腸桿菌性腹瀉是由致病性大腸桿菌感染犢牛引起的一種常見臨床疾病，主要表現(xiàn)為腹瀉、脫水或敗血癥，是新生犢牛死亡的主要病因之一，給養(yǎng)牛業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。目前治療大腸桿菌病主要應(yīng)用抗生素，但藥物治療的效果越來越差，因此研制有效預(yù)防犢牛大腸桿菌性腹瀉的疫苗對預(yù)防該病的發(fā)生具有重要意義。
　　引起犢牛腹瀉的大腸桿菌主要毒力因子包括黏附素、腸毒素（包括LT、ST）和志賀毒素。腸毒素包括不耐熱腸毒素(heat-labile entero

2、toxin，LT)和耐熱腸毒素(heat-stableenterotoxin，ST)。其中不耐熱腸毒素又分為LT-Ⅰ和LT-Ⅱ兩種亞型;志賀毒素也分為兩種，分為1型和2型，志賀毒素1型的毒性要弱于志賀毒素2型。本研究旨在通過將STa的13位氨基酸基因突變與LT-Ⅱc1的B亞基和Stx2的B亞基，通過融合PCR技術(shù)串聯(lián)獲得重組蛋白，并以此作為免疫原研究其誘導(dǎo)小鼠體液免疫的情況，為犢牛大腸桿菌疫苗的研究提供實驗數(shù)據(jù)。
　　本研究經(jīng)PC

3、R分別擴增出LT-Ⅱc1B、Stx2B兩段基因與13位點突變的STa基因，通過柔性linker連接并插入到pMD-18T Simple載體中，經(jīng)序列分析鑒定后，將融合基因插入到表達載體pHUE中，轉(zhuǎn)化宿主菌Rosetta，構(gòu)建重組表達菌Rosetta/pHUE-LT-Ⅱc1B-Stx2B-STa13。誘導(dǎo)表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果顯示，表達的重組蛋白LT-Ⅱc1B-Stx2B-STa13分子量大小約為3

4、8ku，為包涵體表達，Western blot鑒定結(jié)果證明，表達的重組蛋白LT-Ⅱc1B-Stx2B-STa13分別與His單抗和STa單抗發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　選取6周齡的清潔級昆明小鼠，將其分為三組（A組、B組和C組），每組10只（5只正常、5只妊娠），A組腹腔注射重組蛋白包涵體;B組腹腔注射純化重組蛋白;C組腹腔注射PBS對照，免疫三次，每次免疫間隔14d。定期采集A、B、C三組的小鼠血清。間接ELISA檢測結(jié)果顯示:重組蛋

5、白包涵體（A組）、純化重組蛋白（B組）均能使小鼠產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。 A組三免后抗LT-Ⅱc1B血清抗體效價可達到1∶15130，抗Stx2B血清抗體效價為1∶10000，抗STa13血清抗體效價為1∶9744;B組三免后抗LT-Ⅱc1B血清抗體效價為1∶11410，抗Stx2B血清抗體效價為1∶9017，抗STa13血清抗體效價為1∶8807;C組未產(chǎn)生血清抗體效價。A組和B組的妊娠小鼠同樣產(chǎn)生較高的血清抗體效價，兩組乳鼠在30d時仍

6、有效價;C組未產(chǎn)生效價。
　　正常小鼠三免后14d，各組腹腔注射10LD50的Stx2毒素，結(jié)果顯示，A、B兩組小鼠均能得到保護，對照組C組小鼠死亡。乳鼠灌胃實驗結(jié)果顯示，重組蛋白包涵體組和純化蛋白組小鼠血清均可中和STa毒素，無腸積液的產(chǎn)生，對照組仔鼠全部死亡。
　　將三免后的各組小鼠血清系列稀釋后，分別在Y-1細胞和Vero細胞上進行針對LT-Ⅱc1和Stx2對的體外中和試驗。結(jié)果顯示，A組血清對LT-Ⅱc1的中和效價為