白樺脂醇對受損心肌細胞的保護作用.pdf

1、研究背景：
　　心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指心肌血流中斷或下降一段時間后恢復血流供應，造成功能障礙、結(jié)構(gòu)破壞進一步加重的現(xiàn)象。其發(fā)生機制復雜，包括氧自由基、鈣超載、炎癥反應、細胞凋亡和線粒體功能障礙等，而不同路徑又通過各種細胞因子形成網(wǎng)狀交互作用，共同加重細胞損傷。近年來，心肌炎癥反應在心肌缺血再灌注損傷發(fā)生過程中的作用越來越受到重視。多種因素或應激都可使心肌表達并分泌促炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細胞

2、介素1(IL-1)，白細胞介素6(IL-6)，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、細胞粘附分子-1（ICAM-1）等，這些細胞因子通常會導致NF-κ3信號傳導途徑的激活。
　　核因子κB(NF-κ∈B)是哺乳動物細胞內(nèi)的炎癥調(diào)控因子。在炎癥反應過程中，NF-κB被激活后從細胞漿易位至細胞核內(nèi)與特異性的DNA結(jié)合，繼而誘導其下游多種炎癥介質(zhì)基因的表達，導致炎癥反應加重，增加心肌損傷。因此，NF-κB信號傳導途徑的調(diào)控對于心肌細胞炎癥

3、反應有重要的意義。
　　信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)廣泛參與了細胞應激、生長、增殖、分化和凋亡等多種生物學效應。多項研究表明，STAT3參與多種心臟生理、病理活動，如心肌細胞存活、心肌血管再生、線粒體能量代謝、細胞外基質(zhì)變化及炎癥反應等。STAT3的缺乏會引起心肌細胞炎癥和心肌纖維化，增加心功能衰竭的發(fā)生。
　　白樺脂醇(betulin)是從白樺樹皮提取的一種天然有機化學藥物，可以轉(zhuǎn)化為白樺脂酸，具有多種生物活性如

4、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗HIV等作用，引起了人們極大的研究興趣。近期研究還發(fā)現(xiàn)白樺酯醇能通過抑制膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)同時降低膽固醇和三酰甘油，改善肥胖患者的高脂血癥和胰島素抵抗，對2型糖尿病的治療效果明顯。但目前對白樺脂醇對心肌細胞損傷的作用還缺乏研究。
　　本研究的目的是探討白樺脂醇對損傷心肌細胞的保護作用及其信號機制。鑒于炎癥反應在心肌缺血再灌注損傷中的重要作用，課題主要集中于兩部分實驗。第一部分構(gòu)建大鼠

5、離體心臟灌流模型，探討白樺脂醇預處理對缺血再灌注后心肌細胞炎癥的抵抗作用;第二部分以人源心肌細胞AC16為實驗對象，從炎癥反應的角度探討白樺脂醇對心肌細胞的保護作用及其分子信號機制。
　　第一部分：白樺脂醇抵抗心肌細胞炎癥的作用
　　目的：
　　探討白樺脂醇預處理對大鼠缺血再灌注后心肌細胞炎癥的抵抗作用。
　　方法：
　　將50只大鼠隨機分為5組，每組10只。麻醉后快速游離出心臟，置于Langendorff

6、灌流架上，經(jīng)主動脈插管進行灌流。①假缺血再灌注組（Sham）:心臟用K-H液持續(xù)灌流120min。②缺血再灌注模型組(Model):心臟用K-H液平衡灌流50min后，停灌30min再重新灌流K-H液40min。③三個不同濃度的白樺脂醇(Betulin:25/50/100mg/L)預處理組:心臟用K-H液平衡灌流10min后，分別用含有相應濃度白樺脂醇的K-H液灌流5min后，再用不含白樺脂醇的K-H液灌5min，如此反復，共4次，以后

7、的處理同Model組。
　　灌流結(jié)束后從心尖部剪下一小塊心肌組織，立即置于10％的多聚甲醛溶液置于4℃冰箱中，后續(xù)進行心肌組織病理HE染色、TTC染色測定、TUNEL法檢測細胞凋亡和免疫組化測定TNF-α、ICAM-1和NF-κB表達水平;取下剩余的大部分左心室心肌組織剔除結(jié)締組織，制做成心肌勻漿，放入-20℃保存，采用相應試劑盒檢測LDH、CK和MPO活力等生化指標。
　　結(jié)果：
　　1、Model組大鼠心肌組織中C

8、K的活力為14.29±2.08kU/g蛋白，LDH活力為1027±66U/g蛋白，均較Sham組明顯降低(P＜0.01);Betulin組可以濃度依賴性抑制I/R損傷后大鼠心肌組織中CK和LDH漏出入血，尤以Betulin100mg/L組作用更為明顯，CK和LDH活性較Model組明顯增高(P＜0.01)，為22.42±1.44kU/g蛋白和1691±79U/g蛋白。
　　2、與Sham組相比，Model組出現(xiàn)大面積的心肌梗死（I

9、S/AAR％=42.13±6.27），白樺脂醇100mg/L預處理后心肌梗死的面積（IS/AAR％=18.54±4.92）較Model組明顯減小(P＜0.01)，心肌損傷減輕。
　　3、心肌組織HE染色鏡下可見Model組中大鼠心肌纖維出現(xiàn)明顯的波紋狀變和心肌收縮帶，部分纖維斷裂、溶解;Betulin組損傷變化較輕，肌原纖維排列基本整齊，肌節(jié)基本完整，沒有收縮帶和波紋狀變等特征性變化。
　　4、與Sham組相比，Model組

10、TUNEL染色最強，而經(jīng)過白樺脂醇預處理后，TUNEL染色強度呈現(xiàn)劑量依賴性減弱，表明白樺脂醇可顯著抑制心肌I/R引起的細胞凋亡。
　　5、Model組炎癥因子NF-κB、TNF-α和ICAM-1的表達明顯增加，陽性反應的平均灰度值較Sham組增高顯著(P＜0.01);和Model相比，Betulin組NF-κB、TNF-α和ICAM-1的表達均有所降低，以100mg/L組作用更加明顯(P＜0.01)。
　　6、Sham組大

11、鼠心肌組織勻漿中MPO的活力很低（0.15±0.007U/g蛋白），而Model組的MPO活力(0.87±0.012U/g蛋白)較Sham組明顯增高(P＜0.01);而各Betulin組心肌組織中MPO的活力較Model降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　白樺脂醇預處理可以減輕大鼠心肌細胞炎癥反應，保護心肌組織缺血再灌注損傷。
　　第二部分：白樺脂醇改善心肌細胞炎癥的分子機制研究
　　目的：
　　探討白

12、樺脂醇改善人源心肌細胞AC16的炎癥反應及分子信號機制。
　　方法：
　　AC16細胞是購自ATCC從成人心室肌細胞衍生而來的細胞株，以低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞生長融合后分瓶，漂洗、離心出細胞懸液，分裝于培養(yǎng)板中。當細胞密度達到70％-80％時進行分組實驗處理，然后收集細胞上清和細胞，于-80℃冰箱凍存檢測。
　　1、給予空白對照和白樺脂醇4小時后，加入TNF-α賦予，收集細胞上清，通過EILSA實驗檢測IL-6和

13、MCP-1的蛋白濃度，收取細胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄后進行Real-timePCR檢測IL-6、MCP-1、IL-1β等炎癥基因的表達。
　　2、在AC16細胞中轉(zhuǎn)染NF-κB報告基因質(zhì)粒，并給予TNF-α和白樺脂醇刺激。用熒光素酶報告和p65抗體ChIP實驗對NF-κB信號傳導的基因表達進行分析，以評估白樺脂醇對NF-κB在AC16細胞中的轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　3、白樺脂醇孵育AC16細胞后，對STAT3的磷酸化和其下游靶基因SO

14、CS3、BCL-xL的水平進行了檢測，以評估STAT3的活化。
　　4、通過加入STAT3通路的抑制劑AG490和小RNA干擾片段，以檢測STAT3通路是否是白樺脂醇的抗炎效應所必須的。
　　結(jié)果：
　　1、TNF-α能顯著提高AC16細胞中IL-6，MCP-1和IL-1β的mRNA表達水平，而白樺脂醇能顯著抑制TNF-α所誘導的該炎癥基因的表達，細胞中IL-6和MCP-1的蛋白濃度也低于對照組。
　　2、TNF

15、-α能顯著激活NF-κB報告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性，促進P65在核內(nèi)的積聚、磷酸化和乙?；讟逯紕t顯著抑制TNF-α的作用，阻斷NF-κB信號在AC16細胞內(nèi)的活化。
　　3、白樺脂醇孵育AC16細胞后，細胞內(nèi)STAT3磷酸化增強，下游基因-SOCS3和BCL-xL基因的表達顯著增強，證實該過程中存在STAT3通路的激活。
　　4、給予STAT3抑制劑AG490后，白樺脂醇對促炎細胞因子IL-6和MCP-1的表達抑制作用減