鼠疫耶爾森菌特異性抗原的克隆表達與初步應(yīng)用研究.pdf

1、目的：利用基因工程的技術(shù)手段，獲得融合表達的鼠疫菌特異性抗原，建立一種非F1抗原的新型鼠疫快速診斷方法，并與經(jīng)典的鼠疫菌檢測方法相結(jié)合用于解決鼠疫監(jiān)測現(xiàn)場工作中遇到的各種問題。 方法：選取了四個鼠疫菌的特異基因(YP01089、pst、ymt、hmsH)，根據(jù)已發(fā)表的鼠疫菌C092株全基因組序列設(shè)計引物，PCR擴增目的基因片段。實驗中采用pET-30a(+)作為表達載體，通過雙酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)，將目的基因片段定向插入到載體中，

2、構(gòu)建重組表達質(zhì)粒。IPTG誘導(dǎo)，使重組質(zhì)粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中穩(wěn)定高效地表達帶有組氨酸標簽的融合蛋白。Western-blot法鑒定各融合蛋白的免疫反應(yīng)性。應(yīng)用固定化金屬離子親和層析技術(shù)(Ni-NTA柱)純化重組蛋白，并初步建立了基于該重組蛋白的間接ELISA方法。 結(jié)果：實驗獲得了五種融合表達蛋白-重組YP01089、重組Pst、重組Ymt、重組的去掉信號肽的HmsH、重組的完整HmsH，除重組Pst以

3、可溶形式存在外，其他四種均形成了包涵體。且Western-blot結(jié)果顯示重組Pst可與鼠疫診斷血清和確診病人血清發(fā)生特異性反應(yīng)。用純化的重組Pst建立的間接ELISA方法，對86份現(xiàn)場監(jiān)測標本及4份浙江省F1抗體高滴度者的血清標本進行檢測，結(jié)果顯示該方法可以將人和動物的陽性與陰性標本明顯地區(qū)別開來，且經(jīng)統(tǒng)計學檢驗證明存在于浙江F1抗體高滴度者血清中的抗鼠疫菌素抗體的相對含量與健康人無顯著差別。 結(jié)論：基于重組Pst的間接ELI