鼠疫耶爾森菌體內外sRNAs的鑒定與毒力相關sRNAs初步篩選.pdf

1、目的:
　　 隨著高通量測序技術的發(fā)展，越來越多細菌中的非編碼小RNA(smallnon-codingRNAs，sRNAs)被發(fā)現。這些sRNAs不編碼蛋白質，而作為基因表達關鍵調控因子，有利于宿主-細菌之間的相互作用，并在病原體生存的轉錄后調控中起著關鍵作用。本研究旨在發(fā)現鼠疫耶爾森菌體新的sRNAs及其對毒力影響，揭示鼠疫菌在體外生長和體內感染期間相關sRNAs的表達模式，便于將來研究鼠疫耶爾森菌的sRNAs及其功能。

2、>　　 方法:
　　 1.RNA測序和信息學分析:分別提取四種條件，TMH培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基、肺鼠疫模型小鼠肺和小鼠脾內的鼠疫耶爾森菌總RNA，回收50～500ntRNA片段，進行Solexa測序。經過生物信息學分析，篩選位于基因間區(qū)或反義鏈上，且存在于兩個及兩個以上樣品的轉錄本，作為候選sRNAs。
　　 2.候選sRNAs特征的證實:針對上述獲得的候選sRNAs信息，設計相應的特異性引物，經體外轉錄制備地高辛標記

3、的RNA探針，通過Northernblot實驗檢測候選sRNAs存在、大小和穩(wěn)定性;通過引物延伸實驗來確定這些高豐度表達sRNAs的轉錄起始位點。
　　 3.候選sRNAs差異表達的證實:每個RNA樣品，用特異性引物逆轉錄成cDNA后進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)，分析比較候選sRNAs在體內外條件下差異表達情況;通過Northernblot實驗檢測候選sRNAs在體外條件下差異表達情況。
　　 4.鼠疫菌sR

4、NAs缺失突變株的構建:我們篩選部分高表達的sRNAs，采用λRed同源重組技術制備鼠疫耶爾森菌sRNAs缺失突變株。
　　 5.表型實驗和小鼠感染實驗:通過觀察菌落形態(tài)和體外生長，比較鼠疫菌野生株和sRNAs突變株的體外生長相關的表型變化;鼠疫菌野生株和sRNAs突變株分別接種于BHI培養(yǎng)基26℃培養(yǎng)至對數中期，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1hr。大約100個CFU鼠疫菌皮下注射感染6周齡的BALB/c小鼠，觀察14天的死亡情況。
　

5、　 結果:
　　 1.經RNA測序和數據分析，最終發(fā)現了104個鼠疫耶爾森菌的非編碼sRNAs，包括26個在其他基因組中已經注釋的和78個新發(fā)現的sRNAs。
　　 2.Northernblot實驗結果驗證了14個新的小RNA存在，轉錄本長度與RNA測序得到的長度基本吻合，并對sR034等6個sRNAs的大小和穩(wěn)定性進行了初步驗證;引物延伸實驗結果表明，成功確定了兩個sRNAs(sR034和sR035)的轉錄起始位點，

6、與RNA測序結果基本一致。
　　 3.經qRT-PCR證實，發(fā)現CsrB，CsrC，4.5SRNA和sR027等4個sRNAs在感染小鼠肺臟中表達下調。
　　 4.成功構建了sR035等9個鼠疫菌sRNAs缺失突變株。
　　 5.表型實驗證實sRNAssR084、sR035和sR088缺失株菌落呈現光滑表型;小鼠毒力實驗證實，已知毒力相關sRNAssrA缺失突變株的毒力減弱，其他5個sRNAs缺陷變異株沒有減毒。