鞘內(nèi)間斷注射不同濃度羅哌卡因在長時(shí)間對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)毒性影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.觀察鞘內(nèi)間斷注射0.5％和1％羅哌卡因后28天對(duì)大鼠脊髓、神經(jīng)根超微結(jié)構(gòu)的影響及機(jī)制研究，探討ERK信號(hào)通路、Akt信號(hào)通路是否參與了羅哌卡因的脊髓神經(jīng)毒性;觀察鞘內(nèi)間斷注射1％羅哌卡因+神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3)后28天對(duì)大鼠脊髓、神經(jīng)根超微結(jié)構(gòu)的影響及機(jī)制，探討neurotrophin-3(NT-3)是否能減輕和預(yù)防羅哌卡因的神經(jīng)毒性作用。
　　2.體外觀察NT-3對(duì)于羅哌卡因細(xì)胞毒性

2、的影響。為臨床上連續(xù)腰麻更安全使用羅哌卡因提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.改良Yaksh法鞘內(nèi)置管成功的雄性SD大鼠144只，體重280～320g，月齡為1.5月。隨機(jī)分為生理鹽水組（NS組，n=36），0.5％羅哌卡因組（M組，n=36），1％羅哌卡因組（R組，n=36），1％羅哌卡因+NT-3組（T組，n=36）。NS組大鼠鞘內(nèi)注入0.9％生理鹽水、M組大鼠鞘內(nèi)注入0.5％羅哌卡因、而R組和T組大鼠鞘內(nèi)注入1％羅哌卡

3、因各0.12 ml/kg，間隔1.5h給藥一次，持續(xù)給藥12h。其中T組同時(shí)再鞘內(nèi)注入0.1 mg/kg的NT-3。各組均觀察1d、3d、5d、7d、14d、28d。NS組記為“NS1組、NS3組、NS5組、NS7組、NS14組、NS28組”(n=6)。M組記為“M1組、M3組、M5組、M7組、M14組、M28組”(n=6)。R組記為“R1組、R3組、R5組、R7組、R14組、R28組”(n=6)。T組記為“T1組、T3組、T5組、T7

4、組、T14組、T28組”(n=6)。分別檢測給藥前和各時(shí)間點(diǎn)處死前各組大鼠后肢機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值即機(jī)械痛閾和熱潛伏縮爪閾值即熱痛閾以及最后一次給藥后運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分來觀察其行為學(xué)的變化;完成行為學(xué)檢測后的各組大鼠，取脊髓腰膨大及相應(yīng)節(jié)斷行光鏡和透射電鏡觀察，并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分;Tunel法檢測脊髓凋亡;免疫組化檢測各組大鼠腰膨大脊髓ERK1(P44 MAPK)、Akt及caspase-3蛋白的表達(dá);Western-blot檢測各組磷酸化ER

5、K和磷酸化Akt蛋白表達(dá)及相對(duì)定量比隋況。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):體外觀察NT-3對(duì)于羅哌卡因細(xì)胞毒性的影響將PC12細(xì)胞分為三組:對(duì)照組(NS組):不予任何處理，常規(guī)培養(yǎng)48小時(shí);羅哌卡因組（R組）:15mM羅哌卡因干預(yù)48h;羅哌卡因+NT-3組（T組）:15mM羅哌卡因干預(yù)48h并同時(shí)給予NT-3100ng/ml處理48小時(shí)。檢測干預(yù)后每組細(xì)胞計(jì)數(shù);MTT方法測定細(xì)胞成活率的變化;臺(tái)盼蘭染色測定每組細(xì)胞活性;Western bl

6、ot法檢測各組細(xì)胞磷酸化ERK和磷酸化Akt蛋白表達(dá)及相對(duì)定量比情況。
　　結(jié)果:
　　1.NS組和M組各對(duì)應(yīng)時(shí)間組相比，大鼠機(jī)械性觸誘發(fā)痛閾和熱刺激誘發(fā)痛閾無顯著性差異。各組大鼠機(jī)械性觸誘發(fā)痛閾與NS組和M組各對(duì)應(yīng)時(shí)間組相比:R1、R3、R5組和T1、T3組大鼠機(jī)械觸誘發(fā)痛閾升高(P＜0.05)，其中以R1組升高最明顯;與R組相對(duì)應(yīng)時(shí)間組相比:T5組大鼠機(jī)械痛閾顯著降低(P＜0.05)。與NS組和M組各對(duì)應(yīng)時(shí)間組相比:R1

7、、R3、R5組和T1、T3組大鼠熱刺激誘發(fā)痛閾升高(P＜0.05)，其中以R1組升高最明顯。與R組相對(duì)應(yīng)時(shí)間組相比:T5組大鼠熱刺激誘發(fā)痛閾顯著降低(P＜0.05)。
　　2.電鏡和光鏡結(jié)果。電鏡:R組給藥后R1、R3、R5、R7、R14、R28組電鏡超微結(jié)構(gòu)有不同程度的改變。R1組水腫明顯，神經(jīng)細(xì)胞呈固縮狀，核碎裂，大多數(shù)空泡狀，有凋亡小體出現(xiàn)，R3組神經(jīng)細(xì)胞線粒體清晰，核皺縮，神經(jīng)細(xì)胞局灶水腫，R5組部分神經(jīng)細(xì)胞核皺縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

8、輕度擴(kuò)張，神經(jīng)細(xì)胞有部分腫脹，R7組局灶水腫明顯，部分線粒體結(jié)構(gòu)模糊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度擴(kuò)張，部分神經(jīng)細(xì)胞有皺縮，R14組神經(jīng)細(xì)胞腫脹、水腫，線粒體丟失，呈空泡狀，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度擴(kuò)張，R28組郎飛氏結(jié)正常。而T組中的對(duì)應(yīng)時(shí)間組:T1組胞核花邊狀，皺縮，有凋亡小體出現(xiàn)的趨勢，線粒體結(jié)構(gòu)完整，T3組神經(jīng)細(xì)胞核圓，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，輕度水腫，T5組線粒體清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度擴(kuò)張，核完整，輕度水腫，T7組神經(jīng)細(xì)胞核輕度皺縮，部分線粒體空泡狀，水腫部明顯，T

9、14組趨向正常，細(xì)胞核圓，線粒體嵴清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常，T28組形態(tài)正常。光鏡:R1、R3、R5、R7組神經(jīng)元數(shù)量較少，體積明顯縮小，核明顯固縮、深染。個(gè)別神經(jīng)元壞死，部分膠質(zhì)細(xì)胞有增生。R14及R28組神經(jīng)元數(shù)量較多，部分有軸突，部分體積縮小，核固縮、深染。T1、T3、T5組神經(jīng)元數(shù)量減少，體積縮小，核固縮、深染，T5組神經(jīng)元數(shù)量比R5組多，有點(diǎn)狀壞死。 T7組部分神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，大部分可見長軸突，部分神經(jīng)元體積縮小，核固縮、深染

10、，膠質(zhì)細(xì)胞增生。T14組部分神經(jīng)元軸突消失，胞漿少，T28組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量比R28多，形態(tài)正常。R組和T組的各對(duì)應(yīng)時(shí)間組的組織病理學(xué)評(píng)分在1d、3d、5d、7d，14d分別較NS組和M組各對(duì)應(yīng)時(shí)間高，以R組最高(P＜0.05);與R組的各對(duì)應(yīng)時(shí)間組比較， T組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的T5、T7、T14組的組織病理學(xué)評(píng)分顯著降低(P＜0.05)。NS組和M組的電鏡結(jié)果基本正常。
　　3.TUNEL染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果:與NS組的同時(shí)間對(duì)應(yīng)組

11、比較，M組染色陽性細(xì)胞無顯著性增多。與NS組和M組的同時(shí)間對(duì)應(yīng)組比較T1、T3、T5組TUNEL染色陽性細(xì)胞增多(P＜0.05);R組的R1、R3、R5、R7組染色陽性細(xì)胞增多(P＜0.05)。與R組同時(shí)間對(duì)應(yīng)組比較T組的R1、R5、R7組染色陽性細(xì)胞顯著減少(P＜0.05)。
　　4.免疫組化檢測的Akt、ERK1、caspase-3 Akt:R1、R3、R5組以及T1、T3組與NS和M組的對(duì)應(yīng)時(shí)間組比較，脊髓灰質(zhì)后角Akt陽性

12、表達(dá)顯著升高(P＜0.05); T3、T5、T8組與R組對(duì)應(yīng)時(shí)間組比較，Akt陽性表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。ERK1:R1、R3、R5、R7、R14組以及T1、T3、T5、T7組與NS和M組的對(duì)應(yīng)時(shí)間組比較，脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的ERK1陽性表達(dá)顯著升高（P＜0.05）;T1、T3、T5、T14組與R組對(duì)應(yīng)時(shí)間組比較，ERK1陽性表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。 caspase-3:R1、R3、R5、R7、R14組以及T1、T3、T5、

13、T7組與NS和M組的相對(duì)應(yīng)時(shí)間組比較，脊髓灰質(zhì)后角caspase-3陽性表達(dá)顯著升高（P＜0.05）;T1、T3、T5、T14組與R組相對(duì)應(yīng)時(shí)間組比較，caspase-3陽性表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。與NS組的同時(shí)間對(duì)應(yīng)組比較，M組免疫組化檢測的Akt、ERK1、caspase-3無顯著性差異。
　　5.Western blot法測定脊髓腰膨大組織磷酸化ERK以及磷酸化Akt結(jié)果與NS組各對(duì)應(yīng)時(shí)間組相比，M組脊髓腰膨大組織磷酸

14、化ERK蛋白表達(dá)水平以及磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平無顯著性差異。與NS組各對(duì)應(yīng)時(shí)間組相比:R1、R3、R5、R7、R14、R28組和T1、T3、T5、T7、T14組磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.05)，其中以R1、R3組水平降低最明顯;與R組相對(duì)應(yīng)時(shí)間的各組相比:T組與之相對(duì)應(yīng)時(shí)間的T5、T7、T28組磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。與NS組各對(duì)應(yīng)時(shí)間組相比:R1、R3、R5、R7組和T1、T3、T5、T7組磷酸

15、化ERK蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.05)，其中以R1、R3組降低最明顯;與R組相對(duì)應(yīng)時(shí)間的各組相比:T1、T3組磷酸化ERK蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。
　　6.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)說明:與NS組比較，R組和T組的細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率均減少、細(xì)胞活性降低(P＜0.05)，而蛋白表達(dá)均降低(P＜0.05)，與R組相比較，T組的細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率、細(xì)胞活性均增高（P＜0.05），蛋白表達(dá)均升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:<

16、br>　　1.間斷鞘內(nèi)注射0.5％羅哌卡因12h的各組大鼠脊髓神經(jīng)根超微結(jié)構(gòu)、組織病理學(xué)在1～28天無改變。
　　2.間斷鞘內(nèi)注射1％羅哌卡因12h的各組大鼠脊髓神經(jīng)根超微結(jié)構(gòu)、組織病理學(xué)在1～7天發(fā)生改變較重，產(chǎn)生的凋亡細(xì)胞較多。隨著時(shí)間的延長，病理改變逐漸恢復(fù)，在28天時(shí)大部分恢復(fù)正常。
　　3.間斷鞘內(nèi)注射1％羅哌卡因+NT-312h的各組大鼠脊髓神經(jīng)根超微結(jié)構(gòu)、組織病理學(xué)在1～7天發(fā)生改變輕微，產(chǎn)生的凋亡細(xì)胞少。隨著