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文檔簡介
1、目的:骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化能力降低是衰老性肌萎縮發(fā)生機制之一,氧化應激是造成衰老衛(wèi)星細胞成肌分化障礙的重要原因。適量運動訓練可降低衰老衛(wèi)星細胞內氧化應激水平,與成肌分化能力增加相關,但具體機制尚不清楚。研究表明,衛(wèi)星細胞成肌分化過程也是線粒體重構的過程,且線粒體重構可逆向調控衛(wèi)星細胞分化能力及定向性。我們前期工作證明,ROS過高產生氧化應激誘導線粒體異常重構,啟動病理信號;而運動訓練可通過適量上調ROS,發(fā)揮其信號分子效應,進而促進線
2、粒體適應性重構,實現(xiàn)健康效應。本研究從ROS生理/病理雙重作用角度探討運動促衰老衛(wèi)星細胞成肌分化的機制:1)建立衰老性肌萎縮小鼠模型及耐力運動訓練干預模型,利用原代培養(yǎng)技術獲得骨骼肌衛(wèi)星細胞,并體外誘導分化,探討ROS生成、線粒體重構(能量代謝、生物合成、融合分裂、嵴重構)及相關信號通路的變化規(guī)律及潛在關聯(lián);2)并以C2C12成肌細胞為研究對象,觀察成肌分化各時程ROS生成、線粒體重構及相關信號通路的變化規(guī)律,以探討生理條件下它們之間的
3、時序關系;3)對照觀察不同水平外源性H2O2對成肌分化中線粒體重構的影響,進一步驗證“運動通過改變ROS水平和線粒體重構調控衰老衛(wèi)星細胞分化”的假設;并利用mTOR特異性激動劑和阻斷劑干預上述模型,探討mTOR是否參與ROS雙向調控成肌分化的切換機制。
方法:1)雄性C57BL/6小鼠48只,包括青年鼠(2月齡,24只)和老年鼠(12月齡,24只)。分為青年對照組、青年運動訓練組、老年對照組和老年運動訓練組。訓練組小鼠進行12
4、周跑臺耐力訓練。處死后計算腓腸肌濕重/體重比值,并HE染色測量肌纖維橫截面積;剩余肌肉用兩步酶消化法分離骨骼肌衛(wèi)星細胞,免疫化學染色鑒定衛(wèi)星細胞純度;原代培養(yǎng)并體外誘導成肌分化24h。倒置顯微鏡觀察衛(wèi)星細胞成肌分化程度;Oxygraph-2k細胞呼吸測量儀測定透膜細胞中線粒體氧耗速率;熒光素-熒光素酶發(fā)光法測定ATP合成酶活性;JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位;DCFH-DA熒光探針檢測細胞ROS水平和線粒體ROS生成速率;電鏡檢測線粒
5、體超微結構;RT-PCR法檢測MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡxmRNA和MyHCⅡbmRNA表達;Western-blot法檢測細胞MyHC、COXⅣ、Mfn1、OPA1、Drp1、MnSOD、PGC-1α、AMPK、p-AMPK(Thr172)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)和p21蛋白表達量;2)用低濃度馬血清誘導C2C12成肌細胞分化,分別在成肌分化后0h,3h,6h,9h,12h和24h終止分化,收集細胞,測定成
6、肌分化及線粒體重構相關指標(同前);3)建立濃度梯度H2O2干預C2C12成肌細胞分化模型,MTT法檢測細胞存活率,RT-PCR法檢測MyHCmRNA表達,確定促進成肌分化的低濃度H2O2和抑制成肌分化的高濃度H2O2。在C2C12成肌細胞分化起始時分別加入高或低濃度H2O2,分化24h后檢測成肌分化及線粒體重構相關指標(同前)。并在低濃度H2O2干預模型中加入雷帕霉素,在高濃度H2O2干預模型中加入亮氨酸,檢測mTOR在ROS調控成肌
7、分化通路中的角色。
結果:
一、運動和衰老對肌衛(wèi)星細胞分化中線粒體重構和ROS生成的影響
本部分研究中,與青年組比較,老年組肌肉濕重/體重比值和肌纖維橫截面積明顯降低,表明衰老性肌萎縮模型建立成功。老年組衛(wèi)星細胞體外分化24h后,肌管形成數(shù)量、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡxmRNA及MyHC蛋白表達均低于青年組,提示衰老衛(wèi)星細胞成肌分化能力降低。此外,老年組ST3、RCR、MnSOD、COXⅣ、Mf
8、n1、L-OPA1、S-OPA1、Drp1、PGC-1α、Tfam、mTOR、p-mTOR、p21表達均顯著降低;老年組ST4、細胞ROS水平、線粒體ROS生成速率、p-AMPK顯著升高。電鏡結果顯示,老年組線粒體嵴數(shù)量極少且排列紊亂。12周運動訓練部分逆轉了上述衰老對成肌分化、ROS生成、線粒體能量代謝、生物合成、融合分裂及嵴重構的影響。
二、C2C12成肌細胞分化進程中線粒體重構與ROS生成動態(tài)變化
本部分研究中
9、,分化3h時,MyHC、ST3、RCR、ATP合成活力、膜電位、細胞ROS、線粒體ROS生成速率、MnSOD、L-OPA1、Mfn1、PGC-1α、p-mTOR、p-AMPK和p21即開始顯著升高,且升高趨勢持續(xù)至24h。分化6h時,S-OPA1和mTOR表達開始升高,且升高趨勢持續(xù)至24h。分化9h時,Tfam表達開始升高,且升高趨勢持續(xù)至24h。ST4在分化12h和24h時開始升高。COXⅣ在分化24h時才開始明顯升高。Drp1在分
10、化6h和9h時顯著升高,但在12h時開始降低,至24h時恢復至0h水平。
三、外源性H2O2對C2C12成肌細胞分化中線粒體重構的調控機制研究
在濃度梯度H2O2干預C2C12成肌細胞分化實驗中,與0μmol/LH2O2比較,100μmol/LH2O2對細胞存活率無影響,MyHCmRNA表達升高了31%;600μmol/LH2O2使細胞存活率降低了18%,MyHCmRNA表達降低了28%。我們將100μMH2O2定義
11、促成肌分化的低水平ROS,將600μMH2O2定義抑制成肌分化的高水平ROS。進一步研究表明,與0μmol/LH2O2比較,100μMH2O2使成肌分化、線粒體呼吸速率、ATP合成、膜電位、生物合成、融合分裂、嵴重構均顯著上調,加入雷帕霉素抑制甚至逆轉了100μMH2O2對成肌分化和線粒體重構的促進作用;600μMH2O2使成肌分化、線粒體呼吸速率、ATP合成、膜電位、生物合成、融合、嵴重構均顯著下調,加入亮氨酸部分恢復了600μMH2
12、O2對成肌分化和線粒體重構的抑制作用。
結論:
1.耐力運動訓練可通過上調mTOR和PGC-1α表達,促進衰老衛(wèi)星細胞成肌分化中線粒體適應性重構,包括線粒體嵴重構趨向于成熟、線粒體空間結構趨向于融合、線粒體生物合成增加。從而提高線粒體能量代謝水平,繼而通過抑制AMPK活化而增加p21表達,從而促進衰老衛(wèi)星細胞成肌分化;并通過促進MnSOD表達,降低線粒體ROS水平;
2.成肌分化進程中線粒體ROS持續(xù)性增加
13、。成肌分化中線粒體重構的可能時序關系:①成肌分化起始時,線粒體嵴重構首先發(fā)生以促進線粒體的成熟→②線粒體開始融合形成網絡→③線粒體開始分裂并從核周向細胞特定區(qū)域移動再定位→④線粒體重新趨于融合→⑤線粒體生物合成開始。提示分化早期細胞能量水平與線粒體自身呼吸速率及空間構象相關,分化早期細胞能量水平與線粒體生物合成相關;
3.低水平H2O2可通過活化mTOR和PGC-1α,促進衰老衛(wèi)星細胞成肌分化中線粒體適應性重構,包括線粒體嵴重
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