致腎盂腎炎大腸桿菌新基因R049的鑒定和特性的研究.pdf

1、目的: 從國內臨床分離的致腎盂腎炎大腸桿菌（uropathogenic Escherichia coli，UPEC）132中發(fā)現(xiàn)與致病性相關的新基因，并初步了解其特性，為進一步研究UPEC致病機制奠定基礎。 方法: 1．采用PCR方法對UPEC132特異性編碼序列R049片段（789bp）在UPEC菌株和正常人糞便分離大腸桿菌菌株中的分布進行分析。R049片段陽性的菌株經(jīng)脈沖場凝膠電泳后轉膜進行Southern雜

2、交，確認R049片段在受試菌株染色體的分布特征。 2．采用基因組步移技術，以R049片段（789bp）為核心雙向延伸，獲得其5’端和3’端側翼序列，經(jīng)生物信息學分析尋找可能的開放閱讀框R049-ORF，并提交GenBank注冊。 3．構建原核表達系統(tǒng)E．coli BL21（DE3）/pET32a-R049，SDS-PAGE分析目的蛋白表達情況，鎳親和層析純化后的R049重組蛋白免疫小鼠獲得抗血清，ELISA測定血清效價。

3、以此抗血清對UPEC132全菌裂解物以及提取的UPEC132內膜與外膜蛋白進行Western blot分析。 4．觀察UPEC132對人膀胱移行上皮細胞（EJ）的黏附，并且用激光共聚焦顯微鏡檢測綠色熒光蛋白標記的UPEC132是否能夠侵入EJ細胞內部。采用22KHuman Genome Array基因芯片檢測UPEC132感染的EJ細胞的基因表達譜變化，分析感染過程中涉及的信號轉導途徑。相比之下，構建R049-ORF真核表達質粒

4、，將其轉染EJ細胞，檢測基因表達譜的變化，分析差異表達基因的功能。 5．以大腸桿菌無菌毛株K-12 p678-54構建表達R049-ORF的重組菌E．coliK-12 p678-54/pACYC184-R049，該重組菌與E．coli K-12 p678-54分別經(jīng)尿道逆行感染BALB/c小鼠，通過小鼠尿液與腎組織細菌計數(shù)和腎臟病理學檢查觀察兩種菌株對動物致病性的差異。同時以R04q重組蛋白免疫BALB/c小鼠，對免疫組小鼠和未

5、免疫組小鼠經(jīng)尿道逆行感染UPEC132，通過上述檢測分析R049-ORF編碼蛋白對同源性菌株攻擊的免疫保護作用。 結果: 1．R049片段（789bp）在20株UPEC和40株正常人糞便分離的大腸桿菌中陽性率分別為40%（8/20株）和7．5%（3/40株），兩者有顯著性差異（P<0．01）。11株R049片段陽性的菌株經(jīng)脈沖場凝膠電泳和Southern blot分析，其中有6株UPEC陽性雜交帶均為350kb，與國外模

6、型菌株UPEC J96陽性雜交帶不同，提示R049片段在國內UPEC中具有共同聚集性分布的特征。 2．對R049片段（789bp）雙向延伸，獲得其5’端1502bp和3’端1207bp，經(jīng)生物信息學分析獲得一個可能的R049-ORF（1311bp），經(jīng)BLAST搜索未發(fā)現(xiàn)與之相似序列，GenBank注冊號為EF488001。 3．R049重組蛋白表達量占菌體總蛋白26．2%，表達產(chǎn)物以包涵體形式存在，鎳親和層析純化后其純

7、度大于95%。純化的R049重組蛋白制備的抗血清，效價達1：102400以上。經(jīng)Western blot檢測，該抗血清與UPEC132全菌裂解物和UPEC132的外膜蛋白發(fā)生特異性結合，陽性條帶與R049-ORF編碼蛋白預測分子量（47 KD）相一致，表明R049-ORF系編碼UPEC132外膜蛋白的基因。 4．UPEC132對EJ細胞黏附率為（73．20±5．26）%，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌能夠侵入EJ細胞內。UPEC132

8、感染的EJ細胞有29個差異表達基因（1個下調，28個上調），主要涉及細胞增殖與生長、炎癥反應和細胞凋亡，分屬MAPK信號途徑、Toll樣受體信號途徑和誘導細胞凋亡的TNF受體途徑。R049-ORF轉染的EJ細胞IL-6基因上調大于2倍，與炎癥反應有關。 5．分別以重組菌E．coli K-12 p678-54/pACYC184-R049與E．coli K-12 p678-54感染小鼠，尿液與腎組織細菌計數(shù)和腎臟病理學改變無明顯差異

9、。R049重組蛋白免疫小鼠的血清抗體效價為1：25600-1：51200，免疫組小鼠尿液和腎組織細菌計數(shù)均顯著小于未免疫組（P<0．01，P<0．05），但兩組各有部分小鼠腎臟出現(xiàn)嚴重炎癥反應，無明顯差異。提示R049基因未表現(xiàn)出致病性，但R049基因編碼蛋白對同源性菌株的攻擊具有一定的免疫保護作用。 結論: 1．UPEC132新基因R049特異性地與UPEC菌株相關。 2．R049-ORF（1311bp）編碼U