蛋白酶體抑制劑MG132可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)人肝癌7721細胞凋亡.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文蛋白酶體抑制劑MG132可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)人肝癌7721細胞凋亡姓名：方芳申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：申宗侯20070501蛋白酶體抑制劑M G l 3 2 可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)人肝癌細胞7 7 2 1凋亡中文摘要目的蛋白酶體抑制劑是近幾年來抗腫瘤研究的熱點之一，研究發(fā)現(xiàn)其對多發(fā)性骨髓瘤等多種腫瘤細胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。本課題旨在研究蛋白酶體抑制劑M G l 3 2 對人

2、肝癌7 7 2 1 細胞的增殖抑制的影響及誘導(dǎo)凋亡的機制中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的聯(lián)系。方法為觀察M G l 3 2 對7 7 2 1 細胞生長增殖的影響，以不同濃度的M G l 3 2 ( 2 u M ，5 u M ，1 0 u M ) 處理細胞2 4 小時后，用M T T 法檢測7 7 2 1細胞的增殖情況；用流式細胞術(shù)檢測M G l 3 2 對誘導(dǎo)細胞凋亡的情況；為了驗證M G l 3 2 對7 7 2 l 細胞的誘導(dǎo)凋亡作用，采用了H o

3、 e c h s t 染色法在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡；為探討蛋白酶體抑制劑M G l 3 2 影響7 7 2 1 細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的機制，特別是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系，首先擇取了5 u M 濃度的M G l 3 2 處理細胞2 4小時，然后運用以下方法檢測可能參與其凋亡誘導(dǎo)作用的各分子變化；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( R T - P C R ) 和蛋白質(zhì)印跡( W e s t e r n b l o t ) 檢測7 7 2 1 細胞中內(nèi)質(zhì)

4、網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性分子B i p ／G R P 7 8 和X B P - 1 的表達變化；用W e s t e r n b l o t 檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志性分子及凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子C H O P 的表達變化；為了探討細胞通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑參與凋亡的機制，還用W e s t e r nb l o t 方法檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性誘導(dǎo)的e a s p a s e - 1 2 ，以及其下游的e a s p a s e - 9 和c a s p a s e

5、 ．3 的剪切表達情況。 結(jié)果M T T 法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的蛋白酶體抑制劑M G l 3 2 對人肝癌7 7 2 1 細胞的生長增殖有明顯的抑制作用，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)M G l 3 2 處理后的7 7 2 1 細胞出現(xiàn)了明顯凋亡，且這種增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用均表現(xiàn)出濃度依賴性，H o e c h s t染色也發(fā)現(xiàn)了凋亡小體。以濃度為5 u M 的M G l 3 2 處理7 7 2 1 細胞2 4 小時后R T - P C R

6、結(jié)果顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子B i p ／G R P 7 8 的m R N A 表達顯著增高，W e s t e r n b l o t 結(jié)果也可見其蛋白表達的增高；R T - P C R 結(jié)果顯示與陽性對照相比，加藥處理后的7 7 2 1 細胞中X B P l m R N A 未見剪接，W e s t e r n b l o t 結(jié)果也表明了未剪接的X B P l 蛋白表達增加；W e s t e r nb l o t 檢測C H O

7、P 表達發(fā)現(xiàn)其蛋白表達顯著增高。W e s t e r nb l o t 檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡信號通路中標(biāo)志性分子c a s p a s e 一1 2 發(fā)生了剪切激活，其下游的c a s p a s e - 9 和c a s p a s e ．3 也發(fā)生了剪切激活。結(jié)論蛋白酶體抑制劑M G l 3 2 可誘導(dǎo)人肝癌7 7 2 1 細胞出現(xiàn)生長增殖抑制和凋亡，由于泛素一蛋白酶體通路受阻導(dǎo)致大量未折疊和錯誤折疊蛋白堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中引起