蛋白酶體抑制劑聯(lián)合亞砷酸誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)采用蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib，BOR)聯(lián)合亞砷酸(ArsenicTrioxide,ATO)動(dòng)態(tài)觀察對(duì)人急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)細(xì)胞株NB4的凋亡和生長(zhǎng)抑制作用，探討蛋白酶體抑制劑能否增加NB4細(xì)胞對(duì)亞砷酸的敏感性以及和亞砷酸能否協(xié)同誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡，為APL開(kāi)拓新的治療方法，同時(shí)為BOR與ATO二者聯(lián)合應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。 方法

2、：將受試對(duì)象分為9組：正常對(duì)照組(D)；5 nmol/L BOR(Al)，10 nmol/L BOR(A2);0.5μmol/L ATO(B1)，1.0μmol/L ATO(B2)；5 nmol/L BOR+0.5μmol/L ATO(C1)，5 nmol/L BOR+1.0μmol/L ATO(C2)，10 nmol/L BOR+0.5μmol/L ATO(C3)，10 nmol/L BOR+1.0μmol/L ATO(C4)。作用時(shí)

3、間分為三個(gè)水平：24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)，檢測(cè)以下相關(guān)指標(biāo)的變化： (1) 瑞氏-姬姆薩染色后高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化； (2) 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)； (3) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及進(jìn)行細(xì)胞周期分析； (4) 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)抑凋亡基因survivin的表達(dá)變化情況。 結(jié)果： (1) 形態(tài)學(xué)的觀察：細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞外形迅

4、速皺縮，體積明顯減小；核皺縮，染色質(zhì)凝聚成致密團(tuán)塊，隨之細(xì)胞核碎裂成小的圓形致密團(tuán)塊，散布于胞質(zhì)中；晚期產(chǎn)生的細(xì)胞碎片呈簇狀分布于細(xì)胞周?chē)? nmol/L BOR與10 nmol/L BOR作用于NB4細(xì)胞后，光鏡下可觀察到細(xì)胞的凋亡，且隨著藥物濃度的增高，凋亡細(xì)胞的數(shù)量也增多。1μ mol/L ATO+10nmol/L BOR作用于NB4細(xì)胞24小時(shí)后可見(jiàn)核膜皺縮，48小時(shí)部分胞漿內(nèi)見(jiàn)空泡變性，72小時(shí)為凋亡高峰，可見(jiàn)核固縮、核仁裂

5、解、細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)凝集，細(xì)胞部分裂成數(shù)個(gè)質(zhì)膜包裹小體即凋亡小體。 (2) MTT結(jié)果顯示：在同一時(shí)點(diǎn)，與對(duì)照組相比，單藥組與聯(lián)合組均使NB4細(xì)胞生存率顯著下降(P<0.01)，各組呈濃度效應(yīng)關(guān)系。同一藥物濃度作用于不同時(shí)點(diǎn)生存率也明顯不同(P<0.01)，呈時(shí)間依賴性。聯(lián)合組抑制作用明顯優(yōu)于單藥組，以1μmol/L ATO聯(lián)合10nmol/L BOR在72小時(shí)生存率最低(P<0.01)。 (3) 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：BOR

6、組培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)后，S期比例逐漸降低，G1期變化不明顯，而G2/M期逐漸升高，將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期(P<0.01)，ATO組培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)后，同樣將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期(P<0.01)，聯(lián)合組處理細(xì)胞后，均使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期(P<0.01)，兩種藥物之間存在交互作用，1μmol/L ATO聯(lián)合10 nmol/LBOR阻滯率最高，與相同劑量的ATO單用組比較，聯(lián)合組的阻滯率顯著增高(P<0.01)。 對(duì)細(xì)胞凋

7、亡的分析表明，BOR組處理細(xì)胞48小時(shí)后均可見(jiàn)凋亡亞G1期峰，而對(duì)照組無(wú)明顯凋亡峰，凋亡率的高低具濃度依賴性(P<0.01)。BOR能增強(qiáng)ATO對(duì)NB4細(xì)胞的凋亡作用，與相同劑量的ATO單用組比較，聯(lián)合組的凋亡率顯著增高(P<0.05)。兩種藥物之間存在交互作用，10 nmol/L BOR+1μmol/L ATO組處理后凋亡率最高(P<0.01)。 (4) PT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：BOR組與ATO組均能下調(diào)抑凋亡基因survivin

8、的表達(dá)水平，并呈濃度和時(shí)間依賴性(P<0.01)。聯(lián)合組降低survivin的表達(dá)比單藥組明顯，聯(lián)合組與ATO組相同ATO濃度相比，同一時(shí)點(diǎn)survivin的表達(dá)量隨BOR濃度的升高而降低，差異具顯著性(P<0.01)。干預(yù)時(shí)相與兩藥干預(yù)濃度之間存在交互作用(P<0.01)，以1μmol/L ATO聯(lián)合10 nmol/L BOR在72小時(shí)survivin的表達(dá)量最低。 結(jié)論： (1) BOR與ATO單藥應(yīng)用均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋