抑制人肝癌7721細(xì)胞中N-糖鏈加工酶引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種重要的真核細(xì)胞器，它是分泌性蛋白質(zhì)及膜蛋白正確折疊及聚合的場所，還是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣離子貯存庫，糖蛋白的糖基化也開始于其中。因此保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)是維持細(xì)胞生理正常的重要因素。由于葡萄糖或氨基酸饑餓、細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)改變以及其他各種原因?qū)е碌膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)糖基化或二硫鍵形成受阻或其它原因會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的堆積，從而引發(fā)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfoldedproteinresponse，UPR)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(

2、ERstress)。處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞表現(xiàn)出伴侶蛋白基因表達(dá)上調(diào)、泛蛋白．蛋白酶體途徑的基因表達(dá)上調(diào)、蛋白質(zhì)合成受抑制等特征。細(xì)胞正是通過產(chǎn)生UPR-ERstress減少需要折疊的蛋白質(zhì)來源，加強(qiáng)蛋白質(zhì)的折疊及清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累的未折疊蛋白，使細(xì)胞在內(nèi)外環(huán)境不利的情況下仍能存活。如果嚴(yán)重情況下細(xì)胞產(chǎn)生UPR-ERstress仍不能克服內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不斷積累的未折疊蛋白質(zhì)，則內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 人體內(nèi)的蛋白質(zhì)至少有1／3以上

3、是糖蛋白，存在于各種組織和不同細(xì)胞中，具有非常重要的功能。由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成并輸送到高爾基體、溶酶體、細(xì)胞膜和細(xì)胞外的蛋白質(zhì)多數(shù)是糖蛋白。糖蛋白根據(jù)糖鏈結(jié)構(gòu)不同主要分成O-聚糖和N-聚糖兩種。N一聚糖在細(xì)胞總體糖蛋白中的合成是一個(gè)共翻譯(co-translation)過程，隨著翻譯的進(jìn)行肽鏈延伸進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，N．聚糖可被位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔膜結(jié)構(gòu)上的加工酶修飾加工至高甘露糖型，再進(jìn)入高爾基體，繼續(xù)被加工合成。 糖蛋白N．糖鏈的生物合成是由粗面

4、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種十四寡糖在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下轉(zhuǎn)移到天冬酰胺上，形成N一連接寡糖。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Q．葡萄糖苷酶I和II切除該寡糖鏈的3分子葡萄糖，α-甘露糖苷酶再切除1分子甘露糖，形成高甘露糖型的N-糖鏈。高甘露糖型的N-糖鏈進(jìn)入高爾基體被其中的α-甘露糖苷酶I水解掉3分子甘露糖后，繼續(xù)被高爾基體中的其它酶修飾，形成雜合型及其復(fù)雜型N．糖鏈。糖蛋白N．糖鏈的合成是一個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng)，其中任何酶的缺失或異常都將引起N一糖鏈合成異常，甚至導(dǎo)致其它細(xì)

5、胞反應(yīng)。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及高爾基體中的Q．甘露糖苷酶I是一個(gè)非常重要的N．糖鏈加工酶，它是控制高甘露糖型N．糖鏈向雜合型及復(fù)雜型N．糖鏈轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶。一旦其功能發(fā)生障礙，可能引起各種類型N．糖鏈，包括高甘露糖型、雜合型及復(fù)雜型糖鏈的合成異常。過去對甘露糖苷酶的研究主要集中在參與酵母蛋白和一些跨膜蛋白的降解中。而本文針對在人肝癌772l細(xì)胞特異性抑制α-甘露糖苷酶I，是否會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)行研究。DMJ(1-deoxymannojh-i

6、mycin)，1．脫氧甘露糖吉利霉素是高爾基體中的α-甘露糖苷酶I的特異性抑制劑，本論文研究發(fā)現(xiàn)，DMJ可以使人肝癌7721細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，表現(xiàn)為伴侶蛋白GRP78、轉(zhuǎn)錄因子CHOP(C／EBPhomologusprotein)表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子XBPl剪接激活及caspase-12剪切激活。 N．乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V(N-acetylglucosaminyltransferaseV，GnT-V)是另一種分布在高爾基體中

7、的一種重要的N-糖鏈加工酶，它以UDP-GlcNAc為供體底物，催化C2C2七糖二天線階段或C2C2，4八糖三天線階段的N糖鏈分別形成C2C2，6及C2，4C2，6三天線及四天線N糖鏈。GnT-V與惡性細(xì)胞的N一糖鏈變化關(guān)系密切，在腫瘤的形成及發(fā)展過程中起著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用GnT-V反義cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞的方法，獲得穩(wěn)定表達(dá)株ASGnT-V7721。而且，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性分子GRP78和XBPl及PERK的變