臍血CD133+造血干-祖細胞生物學特性的研究和抗CD133單克隆抗體的研制.pdf

1、本課題研究CDl33+造血干／祖細胞的生物學特性，探討其誘導分化和體外擴增，并克隆CDl33基因全長及研制抗人CDl33單克隆抗體，為進一步研究和利用CDl33打下基礎。 1．1臍血CDl33+細胞生物學特性的研究。 本研究從臍血中磁珠分選獲得CD34+CDl33+和CD34+CDl33-兩群細胞，繼而進行體外細胞擴增培養(yǎng)，結果表明兩群細胞均得到顯著擴增。相同擴增體系中CD34+CDl33．細胞擴增倍數均高于CD34+C

2、Dl33+細胞。對CD34+CDl33+細胞擴增后細胞表面抗原譜的動態(tài)變化進行分析顯示，CD34+CDl33+細胞在擴增過程中向CD34+CDl33．細胞演變，進而最后分化為CD34-CDl33．細胞；細胞集落培養(yǎng)表明CD34+CDl33+細胞體外集落細胞形成多于CD34+CDl33-細胞，但沒有顯著性差別。但是CD34+CDl33+細胞以CFU-GM集落為主，而CD34+CDl33-細胞則BFU-E集落占多數：代表早期祖細胞的CFU-

3、GEMM和HPP-CFU的集落數量在CD34+CDl33+細胞組顯著高于CD34+CDl33．細胞組；長期培養(yǎng)啟動細胞測定CD34+CDl33+細胞遠遠多于CD34+CDl33．細胞。流式細胞儀檢測CD34+CDl33+在擴增狀態(tài)下細胞表面粘附分子表達的動態(tài)變化也表明，擴增前后粘附分子沒有顯著改變。 綜上所述，本研究顯示CD34+CDl33+細胞是比CD34+CDl33．細胞更原始的HSPC。對CD34+CDl33+細胞擴增后細

4、胞表面抗原表達的動態(tài)變化進行分析提示，CDl33分子可能是早于CD34的HSPC表面標記。同時通過SCF+FL+TPO細胞因子組合，可以在體外有效對CD34+CDl33+細胞進行擴增，并且HSPC的擴增對粘附分子的表達沒有明顯的影響，提示體外擴增可能不會對HSPC的遷徙和歸巢造成影響。1．2臍血CD133+細胞重建SClD小鼠造血的實驗研究 SCID小鼠造血重建模型可以進行定量評估人HSPC的生物學特性，并確定HSPC植入SCI

5、D小鼠骨髓并重建造血的能力。本研究將CDl33+細胞和擴增后的CDl33+細胞以及CDl33-細胞移植于SCID小鼠，并對造血功能重建進行研究。 44只SCID小鼠，移植前所有小鼠均接受3．0Gy60C0照射，進行實驗分組，在輻照后4小時內由尾靜脈注射移植細胞(CD34+CDl33+和CD34+CDl33-細胞)。繼而觀察實驗小鼠存活狀況，3周后檢測小鼠骨髓人CD45+細胞和人alu基因。實驗結果顯示：移植CD34+CDl33+

6、細胞小鼠存活率明顯高于移植CD34+CDl33-細胞小鼠；在移植新分離和培養(yǎng)擴增CD34+CDl33+細胞的小鼠骨髓中都檢測到CD45+細胞和alu基因的存在。 本研究結果表明：CD34+CDl33+細胞具有比CD34+CDl33-細胞更原始的特性，擴增后的CD34+CDl33+細胞同樣具有植入SCID小鼠骨髓造血重建的能力。 2.臍血CDl33+細胞誘--9分化樹突狀細胞的研究。 本實驗就CDl33細胞和CD3

7、4細胞擴增誘導DC的能力進行比較，并對CD40分子激發(fā)對誘導DC作用進行研究。 從臍血中分離獲得CD34+CDl33+和CD34+CDl33-細胞，新分離和擴增后細胞加不同組合的細胞因子，根據細胞因子組合和加入細胞的不同分組：A組：CD34+CDl33+細胞+(GM-CSF+IL-41．5天+TNF．Q6—9天)：B組：CD34+CDl33．細胞+(GM-CSF+IL-41．5天+TNF．Q6-9天)；C組：擴增7天后CDl33

8、+細胞+(GM-CSF+IL-4卜5天+TNF．-α6—9天)；D組：CD34+CDl33+細胞--I-CD40功能性單抗5C11。對DCs形態(tài)學進行觀察和細胞表型分析以及擴增效率比較，并進行DC與T細胞體外混合淋巴細胞反應試驗。實驗結果顯示：除B組外，其余各組細胞數量均得到有效擴增。以C組擴增效果最為明顯，A、D組則基本相同；對于細胞因子條件相同的A、B組來說，CD34+CDl33+細胞擴增數量是CD34+CDl33．細胞的3．03倍

9、；各組誘導的細胞均表達CDlα、CD83、CD86和HLA-DR，但A組細胞表達上述分子陽性率遠遠大于B組；C組細胞表達DC相關分子略少于A組(但無顯著性差異)，D組細胞基本與C組相當，但D組細胞的CDlQ表達率顯著低于A、C兩組；MLR結果表明，各組均具有激發(fā)同種異體T細胞增殖的功能。A、C、D組間無顯著差異，但均高于B組，其中A組是B組的3．76倍。 本實驗結果表明，具有產生功能性DC的前體細胞主要存在于CDl33+細胞群，

10、同時通過擴增和誘導兩步法可以獲得大量功能性DC，這表明可采用CDl33+細胞來研究DC的分化和發(fā)育的生物學特性；實驗結果也表明，CD40分子激發(fā)可有效地促進CDl33+細胞源DC體外擴增和分化，這為體外誘導DC提供了一條新的途徑。 3.人胎盤來源的間充質干細胞對CDl33+細胞體外擴增的支持作用。 本研究采用胎盤來源的間充質干細胞(humanplactentaderivedmesenchymal-likestemcell

11、s，HPMSC)觀察其對CDl33+HSPC的擴增作用。由胎盤分離培養(yǎng)得到的間充質樣細胞具有BMSCs相似的形態(tài)和細胞表面標志：細胞形態(tài)呈類似成纖維細胞，免疫熒光標記和流式細胞儀檢測顯示該群細胞表達CD29、CD44和CDl05(SH2)分子，但不表達CDllb、CD34、CD45、CDl9、CDl06、HLA-DR、v'~VF、CDll7、FASL,·CD40、CD40L等。對HPMSCs分泌細胞因子進行檢測發(fā)現，HPMSC分泌SCF

12、、IL-6和TNF-tt以及分泌大量的SDF．1α，但不產生IL-3和GM-CSF。CDl33+細胞與HPMSCs共培養(yǎng)后，HPMSCs能有效擴增CDl33+細胞；并且不同擴增時間細胞表面粘附分子沒有顯著性變化。 結果表明：胎盤來源的HPMSC可在體外有效擴增HSPC。一方面大大提高了HSPC擴增的數量和質量，另一方面在HSPC歸巢和抑制免疫排斥方面的作用將大大提高移植的成功率。這也表明移植時同時采用同一個體的胎盤源MSC和臍血

13、CDl33+細胞完全有可行性，這為臍血干細胞移植開拓了新的途徑，具有重要的使用價值。 4．100133—2分子的克隆及其轉基因細胞的構建 研究表明CDl33可能是較CD34更為有價值的HSPC表面標志，隨著研究的進展，CDl33將在多個方面顯示更重要的價值。本研究旨在克隆人CDl33-2全長基因，構建其轉基因細胞，為制備抗人CDl33-2單克隆抗體和研究CDl33-2的生物學功能打下基礎。 根據CDl33-2基因

14、(GeneBank：AF507034)序列，以骨髓cDNA文庫為模板，在分段克隆的基礎上采用人工延伸等手段獲得人CDl33-2基因，裝入PMDl8-T-Vector載體，轉化感受態(tài)DH5a大腸桿菌。重組質粒T-CDl33-2經測序正確。重組質粒T-CDl33-2經PCR擴增CDl33-2全長基因并引入PstI和BamHI酶切位點，裝入逆轉錄表達載體pGEZ-term，轉化感受態(tài)DH5ct大腸桿菌，重組質粒pGEZ-CDl33-2經測序正

15、確。 pGEZ-CDl33-2、輔助病毒載體pHIT456和pHIT60混合后，脂質體法轉染包裝細胞-293T細胞，獲得具有感染能力的重組逆轉錄病毒。將含有完整CDl33-2重組逆轉錄病毒的293T細胞上清混合WEHI細胞上清，感染L929細胞并進行培養(yǎng)，并用不同濃度的Zeocine加壓篩選獲得抗性轉基因細胞的基礎上，采用免疫熒光標記和流式細胞儀分析，獲得穩(wěn)定表達CDl33-2分子的L-CDl33-2轉基因細胞。 本研究

16、利用高質量的cDNA基因文庫提供的高質量模板，采用分段克隆的方法，成功克隆CDl33-2全長基因并構建轉基因細胞，為制備抗人CDl33-2單克隆抗體和進一步研究CDl33的生物學功能奠定物質基礎。 4．2CDl33-2單克隆抗體的研制 以L929-CDl33細胞作為免疫原，免疫Balb／c小鼠。采用B淋巴瘤雜交瘤技術，將免疫Balb／c小鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2／0進行融合，經HAT篩選，以L929-CDl33

17、篩選抗原，經多次亞克隆化及反復篩選，在融合的10塊96孔板中，最終得到1株持續(xù)分泌抗人CDl33-2單克隆抗體的雜交瘤細胞株(1F8)。將雜交瘤細胞注入降植烷(Pristane)預致敏的Balb／c小鼠，誘生腹水?？焖俣ㄐ栽嚰垪l分析法結果顯示：1F8Ig類別為IgGl。 以WERI-Rb．1為競爭靶細胞，采用競爭抑制實驗分析1F8識別的抗原位點。實驗結果表明1F8與商品化單抗293C3識別完全不同的位點。 選擇多個細胞株