OSI-027及其聯(lián)合自噬抑制劑對K562細(xì)胞的生物學(xué)影響及機制的研究.pdf

1、【目的】探討OSI-027及其聯(lián)合自噬抑制劑對慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562的生物學(xué)影響及可能的機制。
　　【方法】常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)待細(xì)胞進入對數(shù)分裂期后用于實驗。1.藥物對K562細(xì)胞生物學(xué)影響的初步觀察：空白對照組細(xì)胞行正常培養(yǎng)，OSI-027處理組以0.1、0.5、1、5、10、20μmol/L濃度的OSI-027處理細(xì)胞，雷帕霉素（RAPA）處理組以1、5、10、20、50、100 nmol/L濃度的RAPA處理細(xì)胞

2、，收集處理后的24h、48h、72h細(xì)胞，以MTT比色法測定細(xì)胞增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度（IC50）；倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況；光學(xué)顯微鏡觀察常規(guī)瑞氏染色后細(xì)胞形態(tài)變化。2.藥物對K562細(xì)胞生物學(xué)影響的機制研究：細(xì)胞分為空白對照組（正常培養(yǎng)）、OSI-027、RAPA、氯喹（CQ）、OSI-027聯(lián)合CQ和RAPA聯(lián)合CQ處理組，收集處理后24h、48h、72h細(xì)胞，AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；P

3、I單染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布；透射電鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化；Western Blotting檢測細(xì)胞中BCL-2、Beclin1、HIF-1α蛋白的表達情況。
　　【結(jié)果】1.MTT結(jié)果顯示，OSI-027對 K562細(xì)胞有明顯增殖抑制作用，且抑制作用呈劑量-時間依賴性，其IC50為6.104μmol/L；RAPA對K562細(xì)胞有一定的增殖抑制作用，IC50為132.640nmol/L。2.細(xì)胞生長狀況觀察顯示，與對照組相比，O

4、SI-027處理組出現(xiàn)了細(xì)胞數(shù)量減少、顏色變暗、抱團生長和破碎等現(xiàn)象，隨藥物濃度升高和時間延長，上述變化更加明顯；RAPA處理組未出現(xiàn)明顯的生長變化，僅見細(xì)胞數(shù)量略微減少等改變。3.細(xì)胞形態(tài)觀察顯示，與對照相比，OSI-027處理組細(xì)胞邊緣破碎，體積縮小，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，核仁消失，核染色質(zhì)粗糙；RAPA處理組未出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化，僅在作用72h時，見細(xì)胞核染色質(zhì)變得較粗糙。4.細(xì)胞凋亡檢測顯示，OSI-027可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，且效

5、應(yīng)高于RAPA作用組（P<0.05），當(dāng)OSI-027聯(lián)合 CQ作用時主要誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，壞死率隨處理時間延長而升高，72h達29.57±1.80％；RAPA對細(xì)胞凋亡影響不大，當(dāng)其聯(lián)合CQ作用時可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且凋亡效應(yīng)強于RAPA單獨作用（P<0.05）。5.細(xì)胞周期檢測顯示，OSI-027及其聯(lián)合CQ可影響K562細(xì)胞的周期分布，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，且隨作用時間延長阻滯效應(yīng)越明顯，以O(shè)SI-027聯(lián)合CQ作用時尤為顯著；R

6、APA聯(lián)合 CQ影響細(xì)胞周期分布較其單獨作用明顯，可使周期阻滯于S期。6.亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察顯示，與對照相比，經(jīng)CQ處理后的K562細(xì)胞形態(tài)較完整；OSI-027處理組可見細(xì)胞胞膜不完整，細(xì)胞器減少，胞核受損、空泡化，核膜、核間隙增厚，染色質(zhì)稀疏；OSI-027聯(lián)合CQ處理組細(xì)胞受損最嚴(yán)重，見胞膜破壞，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器嚴(yán)重丟失，細(xì)胞核破裂、空泡化，核膜受損，核內(nèi)染色質(zhì)基本消失。7.蛋白相對表達檢測結(jié)果顯示，與同時間段對照相比：① OSI-027

7、作用早、中期，可上調(diào)BCL-2蛋白表達(P<0.05)，后期則下調(diào)該蛋白的表達(P<0.05)，當(dāng)其與 CQ聯(lián)合作用時則下調(diào) BCL-2蛋白的表達(P<0.05)；RAPA在作用早、中期，也可上調(diào)BCL-2蛋白表達(P<0.05)，當(dāng)其聯(lián)合CQ作用時，則下調(diào)該蛋白的表達(P<0.05)。②OSI-027可在作用中后期，上調(diào)Beclin1蛋白的表達（P<0.05），當(dāng)其與CQ聯(lián)合作用時，則下調(diào)該蛋白的表達(P<0.05)；RAPA在作用后

8、期可上調(diào)Beclin1蛋白的表達（P<0.05），當(dāng)其與CQ聯(lián)合作用時則下調(diào)該蛋白的表達(P<0.05)。③OSI-027可使HIF-1α蛋白表達下調(diào)(P<0.05)，當(dāng)其與 CQ聯(lián)合作用時，則大幅度下調(diào) HIF-1α蛋白的表達(P<0.05），以作用后期最明顯；RAPA聯(lián)合CQ作用可下調(diào)HIF-1α蛋白的表達(P<0.05)，單獨RAPA對其表達影響不大。
　　【結(jié)論】1. OSI-027可顯著抑制K562細(xì)胞的增殖，且抑制效應(yīng)