自噬抑制劑ly294002對(duì)腺苷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　研究自噬反應(yīng)在腺苷（Ado）誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　肝癌HepG2及Hep3B細(xì)胞培養(yǎng)后按以下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn):
　　1.單丹磺酰尸胺（MDC）染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的自噬小體，觀察Ado處理后自噬小體數(shù)量的變化。
　　2. Western blot測(cè)定Ado處理后微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）水平的變化。
　　3. MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生存率，觀察不同濃度自噬抑制劑ly29

2、4002處理后細(xì)胞生存率的變化。另外，檢測(cè)Ado與ly294002聯(lián)合用藥后是否增加了Ado的細(xì)胞毒性效果。
　　4. Hoechst33258染色觀察細(xì)胞核凋亡形態(tài)學(xué)改變。
　　5. RT-PCR法檢測(cè)Ado處理后細(xì)胞GRP78、PERK、Atg12基因表達(dá)變化；另外，檢測(cè)Ado與ly294002聯(lián)合用藥后Caspase-3、GRP78等基因表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1. MDC染色結(jié)果顯示：細(xì)胞毒藥物Ado

3、處理后細(xì)胞自噬小體數(shù)量增加;western blot結(jié)果顯示LC3-II/LC3-I比值明顯增加(p<0.05)。
　　2. MTT結(jié)果顯示：有效濃度的自噬抑制劑ly294002處理后細(xì)胞生存率明顯降低。2.0 mmol/L Ado與10μmol/L ly294002聯(lián)合用藥，結(jié)果表明聯(lián)合用藥較Ado單獨(dú)用藥細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制(p<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯上升(p<0.05)。
　　3. RT-PCR結(jié)果顯示，Ado處理

4、細(xì)胞后GRP78、PERK、Atg12的mRNA表達(dá)明顯上升（p<0.05）；另外，與單獨(dú)使用Ado相比，ly294002與Ado聯(lián)合用藥后GRP78的mRNA沒(méi)有顯著變化（p>0.05)，Caspase-3、Caspase-9、CHOP、細(xì)胞色素C的mRNA表達(dá)增加（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. Ado通過(guò)非折疊蛋白反應(yīng)（UPR）PERK通路啟動(dòng)肝癌HepG2及Hep3B細(xì)胞自噬反應(yīng)，它是細(xì)胞促生存的響應(yīng)信號(hào)。<