木犀草素對(duì)鼠膀胱腫瘤細(xì)胞T739作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過多種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法觀察木犀草素對(duì)鼠膀胱腫瘤T739細(xì)胞的影響并探討其作用機(jī)制。如MTT法分析木犀草素對(duì)T739細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用和半數(shù)抑制率IC50。Hoechst33258核染色、Caspase-3細(xì)胞凋亡術(shù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，Western blot分析木犀草素引起的周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的變化并推測(cè)存在的分子機(jī)制。
　　方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞株T739細(xì)胞在37℃，5％ CO2條件下，用含10

2、％胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于以下試驗(yàn)。2.細(xì)胞形態(tài)觀察將0.1％DMSO（作為陰性對(duì)照組）、不同濃度的木犀草素(20，40，60，80，100μmol/L)、順鉑10μg/ml(作為陽(yáng)性對(duì)照組)分別加到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T739細(xì)胞中于第6，24，48h觀察細(xì)胞形態(tài)變化，倒置顯微鏡拍攝(200倍)。3.木犀草素對(duì)T739細(xì)胞的增殖抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T

3、739細(xì)胞于96孔板中，接種密度約為每孔1×104個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。饑餓過夜后，分別加入0.1％DMSO、20，40，60，80，100μmol/L木犀草素、順鉑10μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)6，24，48h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入5g/L的MTT10μL后于37℃繼續(xù)溫育4h。吸除上清液，每孔加入100μLDMSO，室溫震蕩溶解結(jié)晶10 min，于570nm(吸收波長(zhǎng))和630nm(參比波長(zhǎng))處測(cè)吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組57

4、0-A實(shí)驗(yàn)組630)/(A對(duì)照組570-A對(duì)照組630)×100％。4.Hoechst33258染色用Hoechst33258對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，可顯示核的變化和凋亡小體。木犀草素處理結(jié)束后，細(xì)胞用PBS洗2遍，4％甲醛4℃固定30 min。吸除固定液，PBS洗2遍，然后用Hoechst33258染色。10min后，PBS清洗細(xì)胞，Zeiss倒置熒光顯微鏡于340nm處觀察和拍攝細(xì)胞。5.Caspase-3活性檢測(cè)對(duì)照組與感染組細(xì)胞培養(yǎng)于

5、96孔板內(nèi)，調(diào)整各孔培養(yǎng)液為100μL，分別于培養(yǎng)24，48h檢測(cè)Caspase-3活性.參照Caspase—Glo(r)3/7 Assay說明書進(jìn)行檢測(cè)，化學(xué)光度計(jì)VarioskanFlash檢測(cè)各孔液體吸光度，數(shù)據(jù)用Skanh Software(version2.4)軟件分析.6.細(xì)胞周期分析對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，PBS洗2遍，70％乙醇，4℃固定過夜。PBS清洗固定細(xì)胞，然后加入1mL含50mg/LPI和1g/LRNas

6、e的PBS，37℃溫育30min。流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA含量和細(xì)胞周期分布。CELLQuest軟件分析數(shù)據(jù)。7.Westernblotting分析對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T739細(xì)胞饑餓12h后，用不同濃度的木犀草素（20，40，60，80，100μmol/L）處理24h，冰上裂解細(xì)胞提取全蛋白。Nanodrop1000檢測(cè)蛋白濃度，取相同蛋白量跑SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。1％BSA封閉2h，一抗孵育2h，二抗孵育1h后，ECL曝光顯影。

7、相機(jī)拍攝X膠片保存結(jié)果。
　　結(jié)果:木犀草素對(duì)T739細(xì)胞有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，48h的IC50為54.9μmol/L，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)T739細(xì)胞經(jīng)木犀草素處理后主要阻滯在G1期。Hoechst33258核染色，Caspase-3活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)木犀草素處理組細(xì)胞凋亡率明顯高于未處理組。Western blot發(fā)現(xiàn)木犀草素可促進(jìn)JNK的磷酸化。
　　結(jié)論:木犀草素對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞T739的作用表現(xiàn)為:木犀草素對(duì)T739