木犀草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究木犀草素（luteolin）對(duì)乳腺癌（breast cancer）細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的作用并探討其分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.在體外實(shí)驗(yàn)，用不同濃度木犀草素分別處理高侵襲轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞和BT549細(xì)胞。劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，評(píng)價(jià)木犀草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移效應(yīng)的影響；細(xì)胞微球體形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的成球能力和流式細(xì)胞術(shù)（fl

2、ow cytometry，F(xiàn)CM）分析細(xì)胞表面CD24/CD44的表達(dá)，評(píng)價(jià)木犀草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞干性化特征的影響；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞間質(zhì)型表面標(biāo)記分子Vimentin和細(xì)胞骨架微絲肌動(dòng)蛋白F-actin的表達(dá)和分布，定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction， QRT-PCR）和免疫印跡實(shí)驗(yàn)（western blot，WB）分別檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞

3、中上皮型標(biāo)記分子 E-cadherin、Claudin-1，間質(zhì)型標(biāo)記分子N-cadherin、Vimentin以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug的mRNA及蛋白表達(dá)水平，評(píng)價(jià)木犀草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的影響。
　　2.不同濃度木犀草素分別處理高侵襲轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞和BT549細(xì)胞，定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中?-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平。另

4、外，分別轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231細(xì)胞目的基因?-catenin的腺病毒載體 Ad-?-catenin和對(duì)照腺病毒載體 Ad-GFP，運(yùn)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)過(guò)表達(dá)?-catenin對(duì)木犀草素影響乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)作用；定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)以及免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析上皮型標(biāo)記分子 E-cadherin、Claudin-1，間質(zhì)型標(biāo)記分子N-cadherin、Vimentin以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄因子Snail、S

5、lug的mRNA及蛋白表達(dá)水平，評(píng)價(jià)過(guò)表達(dá)?-catenin對(duì)木犀草素影響乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換過(guò)程的作用。
　　3.在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，4-5周齡裸鼠隨機(jī)分為4組，包括空白對(duì)照組，木犀草素干預(yù)組，Ad-GFP＋木犀草素組和Ad-?-catenin＋木犀草素組。空白組和木犀草素干預(yù)組以皮下注射乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231（1×106/只）建立裸鼠原位乳腺癌模型，Ad-GFP＋木犀草素組以皮下注射轉(zhuǎn)染帶 GFP標(biāo)記的空載病毒的乳腺癌細(xì)胞

6、 MDA-MB-231（1×106/只）建立裸鼠原位乳腺癌模型，Ad-?-catenin＋木犀草素組以皮下注射轉(zhuǎn)染帶目的基因?-catenin的病毒的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231（1×106/只）建立裸鼠過(guò)表達(dá)?-catenin的原位乳腺癌模型。待原位腫瘤長(zhǎng)至體積約1cm3（14天）后，木犀草素干預(yù)組、Ad-GFP＋木犀草素組和Ad-?-catenin＋木犀草素組每三天腹腔注射木犀草素（100 mg/kg），空白對(duì)照組不做任何干預(yù)措施

7、。8周后，處死小鼠，肺結(jié)節(jié)數(shù)計(jì)數(shù)、HE染色和Ki67檢測(cè)木犀草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的影響以及過(guò)表達(dá)?-catenin對(duì)此影響的作用；免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）和免疫熒光組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)裸鼠原位腫瘤組織中間質(zhì)型標(biāo)記分子 Vimentin、轉(zhuǎn)錄因子 Slug及?-catenin的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)木犀草素對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換過(guò)程的影響及過(guò)表達(dá)?-catenin對(duì)此影響的作用。
　　結(jié)果：

8、>　　1.木犀草素能劑量依賴性地抑制乳腺癌細(xì)胞系中 MDA-MB-231細(xì)胞及BT549細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　2.木犀草素顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換過(guò)程。木犀草素使乳腺癌細(xì)胞從間質(zhì)樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀有螒B(tài)，改變細(xì)胞骨架微絲肌動(dòng)蛋白F-actin的表達(dá)和分布狀態(tài)；木犀草素劑量依賴性地上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中上皮型標(biāo)記分子E-cadherin、Claudin-1的表達(dá)，下調(diào)間質(zhì)型標(biāo)記分子N-cadherin，Vimentin以及轉(zhuǎn)錄

9、因子Snail、Slug的表達(dá)，其中Slug的變化較Snail顯著。
　　3.木犀草素明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的成球能力和細(xì)胞表面CD24low/CD44high干性化標(biāo)記分子的表達(dá)。
　　4.木犀草素劑量依賴性地抑制乳腺癌細(xì)胞中?-catenin蛋白和 mRNA表達(dá)水平。
　　5.過(guò)表達(dá)的?-catenin逆轉(zhuǎn)木犀草素對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換過(guò)程的抑制作用。
　　6.木犀草素明顯減輕裸鼠乳腺癌腫瘤的

10、肺轉(zhuǎn)移和抑制原位腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換過(guò)程，而過(guò)表達(dá)的?-catenin逆轉(zhuǎn)木犀草素的這一保護(hù)作用。肺結(jié)節(jié)數(shù)計(jì)數(shù)、HE染色和Ki67結(jié)果顯示，裸鼠經(jīng)木犀草素干預(yù)后，肺上腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)減少，而腫瘤中?-catenin過(guò)表達(dá)后，肺上腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)增加；免疫組織化學(xué)和免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示，裸鼠經(jīng)木犀草素干預(yù)后，裸鼠原位腫瘤中上皮型分子Vimentin、轉(zhuǎn)錄因子 Slug及分子?-catenin表達(dá)減少，當(dāng)?-catenin過(guò)表達(dá)后， Viment