人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特征及其體外向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、目的:體外分離培養(yǎng)人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞(HAFMSCs，human amniotic fluidmesenchymal stem cells)，觀察其生物學(xué)特性。低溫凍存HAFMSCs三個(gè)月，觀察凍存后細(xì)胞的生物學(xué)特性，找出最佳的凍存方案。體外誘導(dǎo)HAFMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，分別在常氧及低氧環(huán)境下觀察其分化為內(nèi)皮細(xì)胞的能力。
　　方法:采用四種方法分離培養(yǎng)HAFMSCs，用MTT法觀察各組細(xì)胞的增殖能力。流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)檢

2、測(cè)各組細(xì)胞表面抗原CD29，CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，HLA-ABC，HLA-DR等的表達(dá)。比較各組細(xì)胞成脂、成骨的分化能力，及檢測(cè)各組細(xì)胞中OCT-4，Nanog等mRNA表達(dá)水平。用不同成分的凍存液凍存HAFMSCs，凍存三個(gè)月后復(fù)蘇細(xì)胞，并分析其存活率、生物學(xué)特性及分化能力。體外采用VEGF和bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)HAFMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，F(xiàn)ACS分析細(xì)胞vWF、CD31及CD133 mRNA的表達(dá)水平，采用

3、細(xì)胞免疫熒光的方法鑒定誘導(dǎo)分化后細(xì)胞vWF的表達(dá)情況，觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞在Matrigel上形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力。比較低氧環(huán)境與常氧環(huán)境下上述指標(biāo)的差異。
　　結(jié)果:四種不同的培養(yǎng)方法均培養(yǎng)出HAFMscs。其中Chang培養(yǎng)基兩步培養(yǎng)法培養(yǎng)的細(xì)胞，其貼壁時(shí)間、細(xì)胞集落形成時(shí)間及細(xì)胞傳代時(shí)間較其余三組更短，培養(yǎng)1.5天即有細(xì)胞貼壁，4-5天可見細(xì)胞集落形成，細(xì)胞增殖快。四組細(xì)胞均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物CD29、CD44、CD73、

4、CD90，而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34、CD45，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征，各組之間無明顯差異。四組細(xì)胞成骨、成脂誘導(dǎo)成功，并分別通過油紅。染色及von Kossa染色證實(shí)。四組細(xì)胞中均檢測(cè)到OCT-4，Nanog mRNA的表達(dá)。凍存三個(gè)月后的HAFMSCs，以凍存液方案為DMEM：FBS：DMSO=5:4:1的細(xì)胞存活率最高，細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。而復(fù)蘇后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞表型、分化能力及OCT-4，Nanog的表達(dá)與凍存前細(xì)胞相比

5、無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HAFMSCs體外誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)分析比較各組誘導(dǎo)后細(xì)胞中vWF，CD31，CD133等內(nèi)皮相關(guān)標(biāo)記物抗原的水平，以VEGF和bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)組誘導(dǎo)效率最高，Mtrigel上形成毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的能力也最強(qiáng)。低氧環(huán)境下經(jīng)VEGF和bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)組的HAFMSCs內(nèi)VEGF，v WF和CD31的mRNA水平高于其余各組，形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力也明顯強(qiáng)于其余各組。
　　結(jié)論: HAFMSCs具有易獲得、體