RNA干擾下調(diào)宮頸癌Hela細(xì)胞Survivin表達(dá)及其生物學(xué)效應(yīng)的研究.pdf

1、背景：宮頸癌已成為女性近年來(lái)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，是由人類(lèi)乳頭瘤病毒(HPV)引起，在全世界呈發(fā)展中國(guó)家的宮頸癌發(fā)病率較高[1]。每年約有二十多萬(wàn)女性死于此病，我國(guó)每年新增病例為13萬(wàn)以上。預(yù)防與治療宮頸癌是醫(yī)學(xué)界研究的重要任務(wù)。
　　 RNA干擾(RNAi)是近年來(lái)研究腫瘤治療的一個(gè)新領(lǐng)域，是通過(guò)與靶基因同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)的特異轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。其機(jī)制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生干擾RNA(siRNA)，這些siRNA

2、與同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合，特異性酶會(huì)降解靶RNA而至產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象。
　　 Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤組織，由于與細(xì)胞的生存相關(guān)而稱(chēng)為生存素。Survivin與細(xì)胞凋亡的關(guān)系是通過(guò)外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑進(jìn)行[2]。通過(guò)這些途徑能將細(xì)胞色素C從線粒體釋放，這是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。釋放出的的細(xì)胞色素C在dATP存在下能與凋亡相關(guān)因子1(Apaf-1)結(jié)合，使其形成多聚體，并促使

3、caspase-9(半胱氨酸天冬酰胺酶-9)與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，從而進(jìn)一步激活其它的caspase如caspase-3等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Survivin的作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制Caspasc-3和Caspasc-7的活性；或者通過(guò)P21間接抑制Caspase[3]。
　　 目的：本研究采用RNA干擾技術(shù)，針對(duì)人survivin基因mRNA序列構(gòu)建1個(gè)siRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)

4、染后細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)變化及其對(duì)細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)、survlvmmRNA表達(dá)、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)caspase-3酶活性的變化來(lái)分析該過(guò)程導(dǎo)致的細(xì)胞生物學(xué)特征的變化。從而為臨床腫瘤的治療提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：合成survivin基因的有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA序列，克隆到RNA干擾表達(dá)載體pcdna6.2質(zhì)粒上，構(gòu)建pcdna6.2-siRNA(+)和pcdna6.2-siRNA(-)重組質(zhì)粒，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。脂質(zhì)體介

5、導(dǎo)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，提取總RNA及蛋白質(zhì)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)survivinmRNA，并應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。采用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和MTT法檢測(cè)Hela細(xì)胞增殖能力的改變；采用流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)觀察survivin下調(diào)后對(duì)Hela細(xì)胞凋亡生物學(xué)行為的影響，最后通過(guò)Braford法測(cè)定Caspase3蛋白濃度的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建針對(duì)Survivin基因的RNA干擾真

6、核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)并且能夠抑制SurvivinmRNA及蛋白質(zhì)的正常表達(dá)。pcDNA6.2-GW/EmGFP-siR(+)組對(duì)SurvivinmRNA的相對(duì)表達(dá)量在48h干擾效果最佳。
　　 2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pcdna6.2-siRNA(+)質(zhì)粒后，Hela細(xì)胞中SurvivinmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。
　　 3.細(xì)胞增殖能力測(cè)試結(jié)果表明轉(zhuǎn)染

7、Survivin干擾質(zhì)粒后Hela細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率約為11.44％，而陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率約為4.05％。Caspase3蛋白濃度檢測(cè)顯示Survivin基因沉默可升高其活性。
　　 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了針對(duì)Survivin基因的RNA干擾質(zhì)粒，并證實(shí)其在宮頸癌Hela細(xì)胞中可下調(diào)SurvivinmRNA及蛋白的表達(dá)。Survivin基因沉默可以有效抑制人宮頸癌H