L428-MVC-EVC細胞及其NF-κB表型和功能初步研究.pdf

1、因特網(wǎng)上生物信息資源的快速查找與充分利用，為生物醫(yī)學研究者提供了有價值的信息和研究手段。GeneSifter軟件是一個以網(wǎng)絡為基礎集統(tǒng)計分析和生物學功能分析為一體的基因芯片數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，對預測腫瘤易感基因及其相關的信號通路，具有重要的價值，已有不少學者通過GeneSifter軟件尋找感興趣的致癌基因或抑癌基因，為進一步的科學研究和相關實驗提供了科學的依據(jù)。 近年關于霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）腫瘤細胞-

2、H/RS細胞的形成過程及其相關的調(diào)節(jié)機制研究有了很大的進展，初步研究表明H/RS細胞起源于“殘疾B淋巴細胞”，其中潛伏膜蛋白-1（LMP-1）的表達、CD99基因缺失和核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的持續(xù)活化是H/RS細胞形成的三大要素，特別是mic2/CD99基因缺失與H/RS細胞的發(fā)生有直接關系。 用SiRNA技術將人B淋巴瘤細胞株BJAB和IM9的CD99基因沉默，結果可出現(xiàn)像HL一

3、樣的H/RS細胞的典型特征，出現(xiàn)H/RS樣“鏡影細胞”，高表達CD30和CD15；當再將CD99基因轉入上述H/RS樣細胞中，又可使出現(xiàn)的H/RS樣細胞的形態(tài)特征消失，該細胞又恢復到B細胞淋巴瘤原有的表型特征，提示H/RS細胞的發(fā)生及免疫表型的變化與CD99基因表達缺失有關。 由于經(jīng)典型HL（classical Hodgkin lymphoma，cHL）來源于前凋亡生發(fā)中心B（germinal center B-cell，GCB

4、）細胞，調(diào)節(jié)B細胞分化和存活的重要轉錄因子核因子κB基因（NF-κB）也成為研究H/RS細胞的重要因素。NF-κB屬于一個高度保守的轉錄因子家族，作為重要的轉錄調(diào)控因子，NF-κB調(diào)節(jié)很多的基因表達，這些基因與細胞增殖、分化、免疫反應、凋亡、轉化有著密切關系。在培養(yǎng)的HL細胞株和原代H/RS細胞核中檢測到NF-κB與DNA結合的活性持續(xù)升高。在HL病人的活檢標本免疫組化染色也證實存在大量活化的NF-κB/RelA。NF-κB的持續(xù)活化是

5、H/RS細胞生存的必要條件。 本課題組前期研究將高表達mCD99L2基因的小鼠B淋巴瘤細胞株A20細胞的mCD99L2基因沉默，下調(diào)CD99基因的表達，可誘導出H/RS樣細胞的產(chǎn)生，并從免疫表型、生物學特性等方面驗證其具有H/RS細胞部分特性。 如果本研究將低表達CD99基因的人HL細胞株L428細胞上調(diào)CD99基因表達，能否在基因修飾后使其H/RS細胞特性消失或改變？與NF-κB的關系又如何呢？L428細胞株主要由大細

6、胞（直徑≥25um）、小細胞（直徑≤10um）和介于兩者之間的細胞混雜組成，一種細胞系中為什么會出現(xiàn)大小不同的細胞混合共生？是否與NF-κB活化有關？如果抑制NF-κB活化，又會怎樣的改變呢？ 鑒于此，本研究首先利用生物信息學探究CD99基因與NF-κB的關系，然后追蹤觀測比較L428大小細胞的生長周期及轉化規(guī)律，上調(diào)低表達CD99基因的L428細胞株CD99基因，在該細胞獲得穩(wěn)定表達CD99基因克隆株的基礎上，連續(xù)觀測該株細胞

7、中H/RS細胞的形態(tài)及表型改變，并探究bortezomib抑制NF-κB后CD99基因與NF-κB在HL中調(diào)節(jié)關系，為進一步研究HL中H/RS細胞形成的分子機制奠定實驗基礎。 目的： 1.借助生物信息學軟件對CD99基因與HL相關性的基因進行檢索和分析。利用當前常用的基因數(shù)據(jù)庫分析CD99基因和HL瘤組織中各種基因的表達及差異，探尋CD99基因與HL之間的相互關系。 2.以探究CD99基因對HLH/RS細胞的影響

8、，對比轉染CD99基因前后、bortezomib干預前后CD99基因與NF-κB的相關關系，探討CD99基因是否通過NF-κB起作用，并為本研究后續(xù)工作奠定基礎。 3.將L428-MVC、L428-EVC細胞亞系進行細胞周期、凋亡、生長曲線分析，及體內(nèi)成瘤情況觀察，探究CD99基因在HL中所起的作用。 方法： 1.從GEO DataSets下載CD99基因與HL細胞株及組織中的基因芯片數(shù)據(jù)，提交至基因芯片在線分析

9、工具GeneSifter后，對CD99基因與HL所表達的NF-κB進行基因表達差異分析、KEGG通路分析。 2.用計數(shù)板確定細胞數(shù)量，并根據(jù)細胞數(shù)量用含胎牛血清的1640將培養(yǎng)的L428細胞株持續(xù)稀釋成單個大細胞（直徑≥25um）、單個小細胞（直徑≤10um）于96孔板培養(yǎng)細胞，并在光鏡、掃描電鏡下進行連續(xù)觀察其生長周期，并檢測NF-κB的活化情況。 3.利用本課題前期將CD99/mic2基因成功轉染至L428細胞中的細

10、胞株命名為L428-MVC（L428-mic2 vector construct，L428-MVC）的基礎上，通過免疫組化對L428與L428-MVC克隆株細胞的形態(tài)及表型進行對比分析，免疫組化檢測CD99、CD30、CD15、CD2、CD3、CD20、CD79在L428-MVC和L428細胞中的表達；流式細胞術檢測L428-MVC、L428細胞CD30和CD15的表達，光鏡、掃描電鏡、透射電鏡下觀察L428與L428-MVC細胞形態(tài)特

11、征，以轉染空質粒的L428細胞株命名為L428-EVC（L428-empty vector construct，L428-EVC）為對照。應用流式細胞分析技術、MTT法以及體內(nèi)成瘤試驗，觀察CD99基因對L428細胞細胞周期、凋亡、增殖的影響；免疫熒光細胞化學染色方法、Westernblot分析L428轉染CD99基因前后NF-κB的變化，觀察bortezomib對L428細胞、NF-κB抑制的影響、與CD99基因的調(diào)節(jié)關系，以及接種B

12、ALB/c小鼠和BALB/c-nu/nu裸鼠體內(nèi)成瘤試驗的影響。 結果： 1.差異基因分析中發(fā)現(xiàn)，與CD99基因相比，從GeneSifter中挖掘出與HL有關的顯著高豐度基因1568種，除發(fā)現(xiàn)NF-κB基因外，還發(fā)現(xiàn)了脂肪酸合成相關基因。從差異基因KEGG通路分析中發(fā)現(xiàn)NF-κB參與MAPK及TOLL樣受體等信號通路中。 2.經(jīng)持續(xù)稀釋成單個大細胞、單個小細胞的L428細胞，小細胞可分裂轉化成大細胞，大細胞亦可生

13、成小細胞；常見單個大細胞周圍出現(xiàn)多個小細胞圍繞的現(xiàn)象，在此過程中NF-κB一直持續(xù)活化。 3.細胞計數(shù)結果顯示，L428組中的大細胞或H/RS樣細胞（直徑≥25μm）比例為（11.6±1.5）%，L428-MVC組細胞中H/RS樣細胞的比例為（4.6±0.7）%，L428-EVC組為（13.1±1.3）%。L428、L428-EVC細胞CD30和CD15表達陽性，CD99表達則為陰性；而L428-MVC表達CD99則為陽性，同時

14、發(fā)現(xiàn)L428-MVC所表達CD2、CD3、CD20、CD79仍為陰性。透射電鏡發(fā)現(xiàn)轉染CD99基因后的L428細胞胞質內(nèi)脂質體增多，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)L428-MVC細胞表面突起減少。L428-MVC細胞株生長增殖高于L428細胞株和L428-EVC細胞株（P<0.01），其細胞凋亡亦顯著增加，細胞周期阻滯在G2/M期。與L428-MVC細胞相比，免疫組化及Westernblot均顯示L428、L428-EVC表達的NF-κB顯著升高。120

15、nmol/L的bortezomib對L428細胞株抑制后發(fā)現(xiàn)NF-κB阻斷明顯，但并未引起CD99重新表達。L428、L428-EVC及L428-MVC細胞株均未在BALB/c小鼠和BALB/c-nu/nu裸鼠體內(nèi)成瘤。 結論： 1.NF-κB基因持續(xù)活化與H/RS細胞的增殖與轉化密切相關。H/RS細胞則顯示明顯的NF-κB活性，在HL細胞中滅活NF-κB將引起細胞凋亡。 2.CD99基因可導致L428大細胞形態(tài)

16、變小，其特征性的細胞表面標記CD15、CD30消失，CD99基因對L428細胞增殖起正調(diào)節(jié)作用，但同時引起細胞凋亡亦增加，CD99基因對NF-κB起調(diào)控作用，而NF-κB對CD99基因無反調(diào)節(jié)作用，同時CD99基因不增加致瘤性。 3.L428大小兩種腫瘤細胞，小細胞經(jīng)歷從小至大，大細胞可分裂成眾多小細胞的過程，在單個大細胞周圍常出現(xiàn)多個小細胞圍集的現(xiàn)象。 4.上調(diào)HL細胞的CD99基因可導致胞質內(nèi)脂質體含量增多，可能與脂