美洲商陸抗病毒蛋白突變體表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻的初步研究.pdf

1、水稻(Oryza sativa)病毒病害造成水稻的減產(chǎn)與品質(zhì)下降，給糧食生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的防治方法如噴灑農(nóng)藥等往往會(huì)造成環(huán)境及食品的污染，效果也不能持久，而傳統(tǒng)的育種方式也很難滿足生產(chǎn)的需要。目前，利用基因工程手段培育抗病毒的水稻品種成為解決這一病害的最主要手段之一。 美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein，PAP)是從美洲商陸(Phytolaccaamericana L)春季葉片

2、中分離得到的一種核糖體失活蛋白，是迄今研究和應(yīng)用最為廣泛的一種廣譜抗病毒蛋白。大量研究表明其具有抗多種植物病毒、動(dòng)物病毒甚至腫瘤的功能，利用PAP基因己獲得多種具有廣譜抗性的轉(zhuǎn)基因植株，而且在臨床應(yīng)用取得了較好的效果。隨著對(duì)PAP結(jié)構(gòu)、功能、抗病毒機(jī)理及各種突變體等方面研究的深入，PAP顯示了更重要的農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值和醫(yī)學(xué)意義。成熟PAP是全長(zhǎng)PAP翻譯后修飾過(guò)程中去掉N端信號(hào)肽和C端穩(wěn)定區(qū)，共含有262個(gè)氨基酸。成熟PAP C端有25個(gè)氨

3、基酸組成的毒性區(qū)，缺失突變體PAPc沒(méi)有毒性區(qū)域，其細(xì)胞毒性低；定點(diǎn)突變體PAPy是將成熟PAP第123位Tyr突變?yōu)锳la，兩個(gè)無(wú)毒性突變體都具有很強(qiáng)的抗病毒活性。 本實(shí)驗(yàn)從美洲商陸春季葉片中，利用RT-PCR擴(kuò)增得到PAP基因全長(zhǎng)序列。利用PCR技術(shù)獲得成熟PAP及缺失突變體PAPc，并用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變法獲得突變體PAPy，克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，并成功的在原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli BL2l(DE3)pl

4、ysS中得到正確的表達(dá)。將這些能夠正確編碼的基因片段，與真核表達(dá)載體pCAMBIA-1302連接并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌A.tumefaciens LBA4404，采用葉盤(pán)法在該農(nóng)桿菌介導(dǎo)下將三個(gè)目的基因?qū)肫胀煵?Nicotiana glutinosa)，PCR初步驗(yàn)證得到部分轉(zhuǎn)基因植株，為研究和比較突變體PAPc和PAPy的抗病毒能力、抗病毒機(jī)制、對(duì)宿主表型影響及在轉(zhuǎn)基因植物中目的蛋白積累的穩(wěn)定性等方面做了大量的工作。為防治包括水稻條紋病毒(