脫氧雪腐鐮刀菌烯醇影響人正常食管上皮細(xì)胞抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)的時(shí)間效應(yīng).pdf

1、目的：中國(guó)是食管癌的高發(fā)區(qū)，今年來(lái)，食管癌的發(fā)病率在逐年上升。為了研究食管癌的發(fā)生機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)食管癌高發(fā)區(qū)居民飲食中的毒素污染情況進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)10年的監(jiān)測(cè)，系統(tǒng)地探討了黃曲霉毒素、雜色曲霉素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，首次發(fā)現(xiàn)了這三種毒素都可以影響免疫細(xì)胞的功能，降低抗原加工提呈相關(guān)分子的表達(dá)，其中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的作用更為明顯。
　　 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)又名嘔吐毒素(VT)，在我國(guó)一些消化道腫瘤

2、，比如胃癌和食管癌的高發(fā)區(qū)域，DON的污染極為突出，DON的檢出率和檢出量位于各真菌毒素污染之首。有研究表明，DON可以明顯影響人和動(dòng)物的免疫功能。有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，DON的倍半萜烯結(jié)構(gòu)是其抑制免疫功能的本源，它可以抑制轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白合成等過(guò)程，同時(shí)，DON也可以通過(guò)干擾機(jī)體內(nèi)正常的免疫調(diào)節(jié)而增強(qiáng)免疫功能。因此，DON對(duì)免疫功能有正反兩方面的影響，既可以抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答，又可以誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，DON可以抑制免疫細(xì)胞增殖

3、并且誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)可以激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞產(chǎn)生炎癥前細(xì)胞因子，輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。HLA-Ⅰ類分子和抗原加工轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子的正常表達(dá)是保證機(jī)體正常免疫功能的前提。對(duì)于DON作用于人正常食管鱗狀上皮后免疫相關(guān)分子的表達(dá)情況，國(guó)內(nèi)外均鮮有報(bào)道。
　　 本研究運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)，Western blot， RT-PCR方法檢測(cè)了DON(1000μg/L)處理6h、12h、24h、36h小時(shí)后，原代培養(yǎng)的人正常食管上皮細(xì)胞

4、HLA-abc、TAP-1、LMP-2和CNX蛋白和mRNA表達(dá)變化情況，分析了DON處理不同時(shí)間影響抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，進(jìn)一步揭示DON暴露對(duì)人免疫功能可能的負(fù)面影響以及在我國(guó)食管癌高發(fā)區(qū)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的可能作用。
　　 方法：
　　 1、人正常食管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)
　　 在無(wú)菌條件下，將食管粘膜組織用含有青霉素200U/ml、鏈霉素200μg/ml的PBS溶液反復(fù)沖洗至無(wú)血跡為止，剪除粘膜下層

5、多余的血管和結(jié)締組織，置于25g/L中性蛋白酶(Dispase)中消化24h，用眼科鑷將粘膜層撕下，放入25g/L胰酶中，37℃消化20-30min，其后加入等量含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，以1500r/min離心5min，再用PBS溶液清洗2次后，加入K-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基，按(0.1-1.0)×106個(gè)/cm2接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放入37℃5％CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后首次換液，以后每2-3

6、天換液一次。
　　 2、人正常食管上皮細(xì)胞的鑒定
　　 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況，細(xì)胞爬片后用廣譜CK進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定細(xì)胞來(lái)源。
　　 3、實(shí)驗(yàn)分組與處理
　　 當(dāng)人正常食管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿瓶底70％-80％時(shí)，隨機(jī)分為處理組和對(duì)照組。處理組加DON(1mg/ml)至終濃度為1000μg/L，作用時(shí)間為6h、12h、24h和36h，對(duì)照組加入等量的生理鹽水。胰酶消化細(xì)胞并離心收集或

7、細(xì)胞爬片后檢測(cè)各指標(biāo)表達(dá)情況。
　　 4、細(xì)胞總RNA的提取、鑒定及定量
　　 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。1％瓊脂糖電泳鑒定其完整性。紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。
　　 5、RT-PCR應(yīng)用
　　 RT-PCR方法檢測(cè)DON處理不同時(shí)間對(duì)人正常食管鱗狀上皮細(xì)胞HLA-abc、TAP-1、LMP-2和CNX mRNA表達(dá)的影響。采用凝膠分析軟件(BIO-LD)進(jìn)行定量分析，各組以目的基因與內(nèi)參照基因G

8、APDH量的比值表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。
　　 6、細(xì)胞總蛋白的提取和定量
　　 應(yīng)用預(yù)冷的細(xì)胞裂解液加入收集的細(xì)胞中，提取細(xì)胞總蛋白。將提取的蛋白應(yīng)用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。
　　 7、蛋白印跡(Western Blotting)提取的細(xì)胞總蛋白，用Western blot方法，檢測(cè)DON處理不同時(shí)間對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞HLA-abc、TAP-1、LMP-2和CNX蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 8、免疫細(xì)

9、胞化學(xué)染色
　　 細(xì)胞爬片后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行，DAB顯色，顯微鏡下觀察。
　　 9、統(tǒng)計(jì)分析
　　 各項(xiàng)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，用SNK法進(jìn)行兩兩比較。
　　 結(jié)果：
　　 1、原代培養(yǎng)的人正常食管上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定
　　 經(jīng)酶消化的單細(xì)胞懸液接種到玻璃培養(yǎng)瓶后，加入K-SFM無(wú)

10、血清培養(yǎng)基，1-2天單細(xì)胞聚集成細(xì)胞團(tuán)，3-4天開(kāi)始貼壁，細(xì)胞成圓形、橢圓形和多邊形，體積較大，輪廓不清，胞漿透明，胞核大而清，細(xì)胞融合后，排列緊密，呈典型的“鋪路石”狀排列(Fig.3)。成纖維細(xì)胞污染少，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞逐漸減少，最后基本消失。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示90％細(xì)胞呈廣譜CK陽(yáng)性，證明培養(yǎng)細(xì)胞是食管鱗狀上皮細(xì)胞。
　　 2、DON處理不同時(shí)間對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞HLA-abc、TAP-1、LMP-2和C

11、NX表達(dá)的影響
　　 2.1 DON處理不同時(shí)間對(duì)HLA-abc表達(dá)的影響
　　 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示：人正常食管上皮細(xì)胞經(jīng)DON(1000μg/L)處理后，6h-36h處理組HLA-abc蛋白的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比呈先升高再降低的趨勢(shì)。6h和12h處理組高于對(duì)照組水平，24h和36h處理組低于對(duì)照組水平，其中12h處理組與對(duì)照組相比具有顯著性差異，其余各組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。
　　 RT-PC

12、R結(jié)果顯示：人正常食管上皮細(xì)胞經(jīng)DON(1000μg/L)處理后，6h-36h處理組HLA-a mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組水平，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組HLA-a mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸下降至正常水平。其中6h、12h和24h處理組與對(duì)照組相比具有顯著性差異，36h組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。
　　 人正常食管上皮細(xì)胞經(jīng)DON(1000μg/L)處理后，6h-36h處理組HLA-b mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組水平，隨著時(shí)

13、間的延長(zhǎng)，處理組HLA-bmRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸下降。其中6h、12h和36h組與對(duì)照組相比差異有顯著性，24h組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。
　　 人正常食管上皮細(xì)胞經(jīng)DON(1000μg/L)處理后，6h-36h處理組HLA-cmRNA的相對(duì)表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢(shì)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組相對(duì)表達(dá)量有所下降。其中6h處理組顯著低于對(duì)照組水平，12h和24h處理組顯著高于對(duì)照組水平，36h與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。
　　

14、 2.2 DON處理不同時(shí)間對(duì)TAP-1表達(dá)的影響
　　 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示：人正常食管上皮細(xì)胞經(jīng)DON(1000μg/L)處理后，6h-36h組TAP-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比呈先升高再降低的趨勢(shì)，6h處理組高于對(duì)照組水平，12-36h處理處低于對(duì)照組水平，各處理組與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示：人正常食管上皮細(xì)胞經(jīng)DON(1000μg/L)處理后，6h-36h處理組TAP

15、-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比呈先降低再升高的趨勢(shì)。其中6h處理組顯著低于對(duì)照組水平，12h-36h處理組均顯著高于對(duì)照組水平。
　　 2.3 DON處理不同時(shí)間對(duì)LMP-2表達(dá)的影響
　　 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示：人正常食管上皮細(xì)胞經(jīng)DON(1000μg/L)處理后，6h-36h處理組LMP-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組水平且具有顯著性差異。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示：人正常食管上皮細(xì)胞經(jīng)D

16、ON(1000μg/L)處理后，6h-36h處理組LMP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組水平，其中12h和36h處理組與對(duì)照組相比具有顯著性差異。
　　 2.4 DON處理不同時(shí)間對(duì)CNX表達(dá)的影響
　　 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示：人正常食管上皮細(xì)胞經(jīng)DON(1000μg/L)處理后，6h-36h處理組CNX蛋白的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比呈先升高再降低的趨勢(shì)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組相對(duì)表達(dá)量逐漸下降至正常水平，

17、其中12h處理組達(dá)最高點(diǎn)且顯著高于對(duì)照組水平，其余各處理組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示：人正常食管上皮細(xì)胞經(jīng)DON(1000μg/L)處理后，6h-36h處理組CNX mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組水平，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組相對(duì)表達(dá)量有所下降，其中12h和36h組與對(duì)照組相比有顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、酶消化法加K-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的人正常食管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)好，細(xì)胞融

18、合快，成纖維細(xì)胞污染基本消除，細(xì)胞純度高，10-12天細(xì)胞便可以鋪滿瓶底的70％-80％，這種方法培養(yǎng)的細(xì)胞可以凍存、復(fù)蘇和傳代，是本實(shí)驗(yàn)獲得的原代培養(yǎng)食管上皮細(xì)胞的最佳方法。
　　 2、在處理6h-12h范圍內(nèi)，DON(1000μg/L)可以在蛋白及mRNA水平上促進(jìn)人正常食管上皮細(xì)胞HLA-abc、LMP-2和CNX的表達(dá)，在mRNA水平上促進(jìn)TAP-1的表達(dá)。在處理12h-36h范圍內(nèi)，DON(1000μg/L)對(duì)HLA-

19、abc、LMP-2、CNX蛋白及mRNA和TAP-1 mRNA的促進(jìn)作用明顯減弱。
　　 3、在處理6h-36h范圍內(nèi)，DON(1000μg/L)對(duì)人正常食管上皮細(xì)胞TAP-1蛋白無(wú)明顯影響。
　　 4、在處理6h-36h范圍內(nèi)，DON(1000μg/L)可以影響人正常食管上皮細(xì)胞HLA-Ⅰ類分子及其相關(guān)分子的蛋白和mRNA的表達(dá)，而且隨處理時(shí)間不同影響也不同，變化比較復(fù)雜。短時(shí)間內(nèi)DON表現(xiàn)為促進(jìn)作用，隨著處理時(shí)間的延